稳定表达转录因子FoxA1或FoxM1对干细胞多能性及其分化潜能影响的研究

摘要

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化增殖潜能的原始细胞。叉头匡蛋白家族是细胞内一类非常重要的转录因子,参与了细胞的新陈代谢,发育,分化,增殖,凋亡等几乎所有的生理过程。本文以P19EC细胞作为研究体系,重点研究了Fox家族的两个重要成员FoxA1和FoxM1。
　　 为了研究FoxA1对干细胞多能性及分化潜能的影响,我们构建了能在P19细胞中稳定表达GFP-rFoxA1融合蛋白的细胞株。通过分析发现,P19 GFPFoxA1细胞株能正常表达多能性关键基因如Oct4,Nanog和Sox2,但是它也能表达神经干细胞标志基因Nestin和神经特异性基因TubulinβⅢ。同时,我们检测到细胞株的碱性磷酸酶的活性明显下降,而阶段特异性胚胎抗原SSEA-3和神经干细胞相关膜蛋白Prominin-1出现了高表达。这些暗示了细胞株呈现部分神经干细胞的特征。在RA诱导P19细胞分化的过程中,P19 GFPFoxA1细胞株在分化的早期就能看到多能性基因Nanog的迅速下调,而TubulinβⅢ在分化的早期增加的更快些,暗示FoxA1的高表达可能可以促使细胞更早地启动分化。所以我们认为在P19细胞中高表达FoxA1,可能会使P19细胞变成类似于神经干细胞的细胞。
　　 本文还通过构建P19 GFPFoxM1稳定细胞株来探究FoxM1与细胞多能性维持的关系。通过分析发现,在RA诱导的分化的过程中,FoxM1的稳定高表达使细胞不易形成胚胎小体,多能性关键基因如Oct4、Sox2也能更持久的维持表达,说明FoxM1可能对维持干细胞的多能性起重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

第1章 绪论

1.1 干细胞

1.1.1 干细胞简介

1.1.2 P19EC细胞

1.2 转录因子

1.2.1 叉头匡家族转录因子

1.2.2 转录因子FoxA1

1.2.3 转录因子FoxM1

1.3 维甲酸(RA)诱导干细胞的神经分化

1.3.1 维甲酸简介

1.3.2 维甲酸诱导P19EC细胞的神经分化

1.3.3 神经干细胞

1.4 本文构思

1.4.1 研究目的及意义

1.4.2 研究方法和技术

第2章 表达质粒的构建

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.3.1 引物的设计及目的基因的克隆

2.3.2 酶切、纯化、连接及转化

2.3.3 质粒的小提及酶切鉴定

2.3.4 质粒的转染及荧光素酶报告基因检测

2.3.5 质粒大提

2.4 实验结果

2.4.1 目的基因rFoxA1的PCR产物电泳图

2.4.2 质粒电泳图

2.4.3 酶切鉴定的电泳结果

2.4.4 质粒图谱

2.4.5 质粒共转染及荧光素酶报告基因检测

2.4.6 质粒大提

2.5 讨论

第3章 P19 GFPFOXA1稳定高表达细胞株的构建及表型分析

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.3.1 P19细胞的培养及质粒转染

3.3.2 G418筛选细胞株

3.3.3 细胞株鉴定及分析

3.4 实验结果

3.4.1 P19 GFPFoxA1稳定高表达细胞株的鉴定

3.4.2 P19 GFPFoxA1稳定高表达细胞株的分析

3.5 讨论

第4章 P19 GFPFOXM1稳定高表达细胞株的构建及表型分析

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.3.1 P19 GFPFoxM1细胞株的构建

4.3.2 细胞株的鉴定及分析

4.4 实验结果

4.4.1 P19 GFPFoxM1稳定高表达细胞株的鉴定

4.4.2 P19 GFPFoxM1细胞表型分析

4.5 讨论

结论

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录

附录B 常用缓冲液和试剂配方

附录C 常用仪器

致谢