转录因子Nanog基因在乳腺癌干细胞中的表达及其功能研究

摘要

目的：建立以细胞表面标志物CD44+CD24-和悬浮微球体培养的乳腺癌干细胞分选、富集的方法,阐明转录因子Nanog基因及其不同转录本在乳腺癌干细胞中的表达特征和功能,对以Nanog为靶点的乳腺癌干细胞靶向治疗进行初步探索. 方法：对乳腺癌细胞系MCF-7分别以CD44+CD24-作为标志物进行FACS分选和体外无血清悬浮微球体培养以富集乳腺癌干细胞;Western Blot和免疫荧光检测微球体和贴壁细胞中Nanog的表达差异及其细胞定位;Real-time PCR检测Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干细胞相关基因在CD44+CD24-和non-CD44+CD24-细胞中的表达差异,以及Nanog三个不同转录本在CD44+CD24-细胞中的表达差异;用所构建的NanogRNAi慢病毒载体感染目的乳腺癌细胞,建立稳定表达shNanog的细胞模型,评价shNanog-LV对乳腺癌细胞干细胞特征的影响;检测shNanog-LV对乳腺癌细胞分化标志物和干细胞相关基因表达的影响. 结果：MCF-7细胞中CD44+CD24-比non-CD44+CD24-亚群细胞具有更强的微球体形成能力；Nanog不但在微球体中的表达水平明显高于贴壁细胞，且在CD44+CD24-细胞亚群中的表达水平也明显高于non-CD44+CD24 -细胞，Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notchl和ABCG2等干细胞相关基因在CD44+CD24 -细胞中显示出高表达；转录本Nanogp8在CD44+CD24 -细胞中的表达水平明显高于Nanogl和Nanog2；Nanog主要表达于MCF-7细胞的细胞核中，但细胞质也有一定程度的表达；构建的shNanog-LV可以有效抑制Nanog的表达，并能显著减少乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力；shNanog-LV可以减少乳腺癌细胞中CD44+CD24-的比例，上调乳腺癌细胞分化标志物CK14和CK18的表达水平，下调Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notchl和ABCG2等干细胞相关基因的表达水平。 结论：细胞表面标志物CD44+CD24-分选和悬浮微球体培养是有效的乳腺癌干细胞富集方法；Nanog在乳腺癌干细胞富集亚群中较非乳腺癌干细胞亚群中的表水平明显升高；shNanog-LV介导的Nanog基因沉默可以抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成，以及抑制其肿瘤干细胞特征，包括抑制微球体形成、CD44+CD24-细胞比例、干细胞相关基因的表达和上调分化标志物的表达等。