取代逆转录法精确测量非编码RNA转录水平的方法研究

摘要

有关非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的研究已成为生命科学目前最前沿的方向之一。绝大多数人类非编码已经鉴定出来，各大数据库也保存了其序列可供查询。在与非编码RNA相关的研究中，检测它转录水平的变化是非常关键的数据。该数据表征或预示人类是否健康和处于某种疾病，可以成为临床诊断的依据之一。实时荧光定量PCR常与逆转录联用(RT-qPCR)广泛地应用于非编码RNA的检测，但由于逆转录非编码RNA的效率不稳定，使许多有重大意义的研究结果都无法重现。该论文对可取代逆转录法精确测量非编码RNA转录水平的方法——杂交连接法进行了各方面地研究及探讨。
　　本研究使目标ncRNA与两个和它完全互补配对的DNA片段进行杂交，形成ncRNA-oligos杂合链。最后用T4 DNA连接酶进行缺口修复得到HL-DNA，然后以此为模板进行PCR扩增，用PAGE胶电泳所得产物进行分析，或直接用于荧光定量PCR的检测。将上述合成HL-DNA的方法称为“杂交连接法”（简称“交连法”），所构建的体系称为“交连检测体系”。初步试验成功，使用杂交连接法替代逆转录法制备出对应目标非编码RNA的单一DNA片段(HL-DNA)，可以取代cDNA作为PCR扩增模板定性检测特定非编码RNA，且比cDNA更灵敏。
　　将杂交连接法与荧光定量PCR联用(HL-qPCR)为检测特定非编码RNA转录水平提供了更优越的检测环境。由于排除了其它干扰，对扩增反应引物对的特异性要求没有RT-qPCR严苛;HL-qPCR测定特定非编码RNA的相对浓度，比RT-qPCR更准确、可重现性更高。
　　发现杂交连接法还可以检测T4 DNA连接酶活性，排除了检测过程中容易产生假阳性信号的各种干扰，检测安全可靠。同时，可通过提高了底物浓度和替换染色方式等途径使检测更加灵敏。
　　综上所述，研究通过合理的实验条件设计，成功地使用交连法定性和定量地检测了特定ncRNA。相比随机引物法，交连法跨越了逆转录这一步直接针对目标ncRNA，为检测特定ncRNA转录水平提供了更优越的检测环境同时对检测效率也有所提升，若用其检测不同时期细胞中同一ncRNA的转录量可信度更高，更能够真实地反映出其转录水平的变化。并且，此检测体系还可以进一步拓展应用于酶活性的检测。

目录

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摘要

插图索引

缩略词

第1章 绪论

1．1 非编码RNA概述

1．1．1 ncRNA的发现

1．1．2 短链的ncRNA

1．1．3 长链的ncRNA

1．2 ncRNA与疾病

1．2．1 ncRNA与癌症

1．2．2 ncRNA与神经性疾病

1．2．3 ncRNA与其他疾病

1．3 ncRNA检测技术的研究进展

1．3．1 ncRNA研究的网络资源

1．3．2 逆转录与实时荧光定量PCR技术联用(RT-qPCR)

1．3．3 高通量的检测技术

1．4 论文研究思路

第2章 交连检测体系与PCR扩增反应的联用

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验仪器及耗材

2．2．2 材料与试剂

2．2．3 细胞体外培养

2．2．4 总RNA的提取

2．2．5 总RNA的提纯

2．2．6 总RNA的检测

2．2．7 随机引物法逆转录RNA

2．2．8 互补DNA片段与对应ncRNA杂交

2．2．9 T4 DNA连接酶反应

2．2．10 PCR体外扩增与检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 HL-PCR方法的建立

2．3．2 HL-DNA取代cDNA检测ncRNA的灵敏度

2．3．3 使用HL-DNA取代cDNA检测AK026510

2．3．4 用杂交连接法与PCR扩增联用检测ncRNA

2．4 小结

第3章 交连检测体系与荧光定量PCR的联用

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验仪器

3．2．2 材料与试剂

3．2．3 细胞体外培养

3．2．4 总RNA的提取

3．2．5 总RNA的提纯

3．2．6 总RNA的检测

3．2．7 随机引物法逆转录RNA

3．2．8 互补DNA片段与对应ncRNA杂交

3．2．9 T4 DNA连接酶反应

3．2．10 系列标准样品的制备

3．2．11 荧光定量PCR

3．3 结果与讨论

3．3．1 杂交连接法对PCR引物特异性要求

3．3．2 HL-qPCR法与RT-qPCR法检测目标ncRNA的准确度

3．3．3 HL-qPCR法与RT-qPCR法检测目标ncRNA的可重现性

3．3．4 使用HL-qPCR法检测不同细胞系中目标ncRNA的相对浓度

3．4 小结

第4章 交连检测体系在酶活性检测上的应用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验仪器

4．2．2 材料与试剂

4．2．3 细胞体外培养

4．2．4 总RNA的提取

4．2．5 总RNA的提纯

4．2．6 RNA提取物的检测

4．2．7 互补DNA片段与对应ncRNA杂交

4．2．8 T4 DNA连接酶反应

4．2．9 PCR体外扩增与EB染色检测

4．2．10 银染法检测PCR扩增后产物

4．2．11 考马斯亮蓝法测定T4 DNA连接酶浓度

4．3 结果与讨论

4．3．1 T4 DNA连接酶浓度的测定

4．3．2 交连检测体系用于T4 DNA连接酶活性检测

4．3．3 底物浓度对检测体系灵敏度的影响

4．3．4 EB染色和银染检测灵敏度的对比

4．3．5 使用银染法提高酶活性检测灵敏度

4．4 小结

结论

参考文献

攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢