一种新的细菌吡喃糖氧化酶的表达及其催化性质研究

摘要

我国作为一个农业大国，水稻秸秆资源数量巨大。水稻秸秆中木质纤维素含量丰富却难以降解，其有效利用对解决能源危机与环境污染问题具有十分重要的现实意义。生物法降解利用水稻秸秆具有无污染、成本低、操作简单等优点，具有很大的发展潜力。本实验室前期研究中从水稻种子中分离筛选得到了一株能够高效降解水稻秸秆材料的内生细菌Pantoea ananatisSd-1，对其全基因组进行了测序。Sd-1基因组中出现了编码GMC家族氧化还原酶的基因，可能编码着一种新的吡喃糖氧化酶。这是目前被报道的第二个细菌吡喃糖氧化酶，其具有在生物应用中取代真菌吡喃糖氧化酶的潜能。为了进一步对该基因编码的蛋白进行研究，本论文主要开展了以下实验：
　　（1）吡喃糖氧化酶基因（P2O）的原核表达与纯化：通过对P.ananatis Sd-1全基因组数据的分析、系统发育进化树构建、保守结构域分析、蛋白氨基酸序列比对和蛋白空间结构预测，推断Sd-1全基因组中出现的可能编码GMC家族氧化还原酶的基因编码蛋白为一种细菌吡喃糖氧化酶。进一步通过对该基因的克隆、原核表达与纯化及其条件优化，获得了在大肠杆菌中表达的吡喃糖氧化酶蛋白。
　　（2）吡喃糖氧化酶蛋白的生化性质研究：纯化后的P2O蛋白会形成与真菌类似的同源四聚体，而与已有报道的细菌吡喃糖氧化酶不同，证实其为一种新的吡喃糖氧化酶；不同酶活影响因素表明，该蛋白最适反应pH为6.5，最适反应温度为50℃，最适反应底物为葡萄糖；另外，对该蛋白在木质素材料降解过程中对漆酶的影响进行了探究，证实其对细菌漆酶降解木质素材料具有一定的促进作用。
　　（3）吡喃糖氧化酶基因的同源过表达：构建过表达载体，在P. ananatisSd-1中进行P2O基因的过表达。蛋白在Sd-1菌株中表达成功，但由于受木质纤维素底物诱导后过表达 Sd-1菌株中较高水平的过氧化氢积累，最终导致了菌体的死亡，这也进一步证实了P2O在其自身表达体系中的高效酶活力。
　　本论文对内生细菌 Sd-1中的吡喃糖氧化酶基因进行了表达鉴定，获得了一种新的细菌来源吡喃糖氧化酶，对其生化性质及对其他酶类的影响等进行了研究，为今后对该酶蛋白的改造与应用提供可能，也为探明 Sd-1降解水稻秸秆等木质纤维素材料的机制打下了基础。

目录

声明

第1章 绪 论

1.1水稻秸秆资源现状及其降解研究进展

1.2 木质素的生物降解

1.3吡喃糖氧化酶

1.4 论文选题背景、研究内容及思路

第2章Pantoea ananatisSd-1中吡喃糖氧化酶基因的克隆、原核表达与蛋白纯化

2.1 前言

2.2 实验材料、仪器与方法

2.3 实验结果及其分析与讨论

2.4 本章小结

第3章Pantoea ananatis Sd-1中吡喃糖氧化酶的催化性质研究

3.1 前言

3.2 实验材料、仪器与方法

3.3实验结果及其分析与讨论

3.4 本章小结

第4章Pantoea ananatisSd-1中吡喃糖氧化酶基因的同源过表达

4.1 前言

4.2实验材料、仪器与方法

4.3 实验结果及其分析与讨论

4.4 本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的论文和专利

附录B 碱基序列

致谢