人miR--302a调控IRF5基因表达在流感病毒感染机制中的研究

摘要

流感病毒归属于正粘病毒科，H3N2是根据病毒颗粒包膜表面的病毒蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性进行分类的病毒亚型。流感病毒除感染人类外，还可以感染鸟和猪。通过不同种类的亚型进行基因重组，H3N2可以增强致病力，导致全球范围内的爆发性流行。例如甲型H1N1流感(2009pdmH1N1)是由H3N2和H1N1重组，在2009年全世界范围内引起巨大的恐慌，造成巨大的经济损失。因此，研究流感病毒的特性和病理性对公众健康非常的重要。 流感病毒主要感染上呼吸道表皮细胞，除此外还可以感染吞噬细胞和树突状细胞。流感病毒可引起宿主的先天和获得性免疫反应。通过被感染的宿主细胞模式识别受体TLR7和RIG-Ⅰ识别，流感病毒可以激活干扰素和炎症因子的表达，例如IL-6、IL-8和TNF-α等，行使抗病毒功能。除此外流感病毒还有自己的一套免疫逃逸机制，例如通过NS1蛋白阻止NF-κB通路和Ⅰ型干扰素的激活和表达。本文主要通过筛选流感病毒H3N2感染中表达谱发生变化的miRNA，研究并证明miRNA靶定的下游基因，以及两者的负反馈调节在病毒介导的宿主免疫反应中的作用机制。 实验的方法包括采用生物信息学技术预测miRNA的靶定基因，构建携带基因3'UTR序列的荧光色素酶质粒，将其与miRNA mimics/inhibitors共转，检测双荧光色素酶的活性，验证miRNA的调控作用。通过荧光定量PCR和蛋白质印迹法进一步验证。转染miRNA或者过表达质粒进入细胞后采用病毒或者TLR激动剂刺激细胞，通过荧光定量PCR分析下游的病毒RNA或者细胞因子的mRNA表达水平，从而判断是否发挥调控作用。 本文从microRNA芯片中筛选出了miR-302a，发现H3N2刺激A549约4小时后miR-302a表达量下调。转染miR-302a mimics可以促进流感病毒在A549细胞内的复制和转录，转染miR-302a inhibitors可以降低内源性的miR-302a，从而抑制流感病毒在A549细胞内的复制和转录。通过生物信息学软件预测确定靶标为IRF5基因，通过三个实验:双荧光色素酶活性分析、荧光定量PCR和蛋白质印迹法确定miR-302a对IRF5的调控作用。IRF5是重要的免疫调控因子，可以激活下游干扰素和炎症因子的表达，抑制病毒的复制和转录。MiR-302a通过抑制IRF5的表达促进病毒侵染和阻遏抗病毒反应。由于IRF5参与TLR7介导的信号通路，通过实验证明miR-302a/IRF5的负反馈调控在A549和THP-1细胞中TLR7信号通路中也发挥着相当的作用。综上所述，本论文阐明了一个流感病毒H3N2感染作用中，miR-302a靶定IRF5基因，参与宿主免疫反应的抗病毒调控机制。

目录

声明

摘要

1.引言

1.1流感病毒简述

1.1.1流感与流感病毒

1.1.2 A型流感病毒的基因组结构和生物学特性

1.1.3 A型流感病毒的复制周期

1.2流感病毒与机体免疫

1.2.1识别与逃逸

1.2.2细胞因子的诱导与产生

1.3 MicroRNA简介

1.3.1 MicroRNA的定义

1.3.2 MicroRNA的产生

1.3.3 MicroRNA的机制

1.3.4 MicroRNA与病毒诱导的免疫反应

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1流感病毒株

2.1.2细胞系与菌株

2.1.3质粒

2.1.4小分子干扰RNA

2.1.5实验试剂

2.1.6仪器设备

2.1.7引物

2.2实验方法

2.2.1细胞系的培养

2.2.2质粒的构建

2.2.3转染

2.2.4 Luciferase活性检测

2.2.5基因的mRNA表达的分析

2.2.6 Western Blot

2.2.7统计学分析

3实验结果

3.1 miR-302a对流感病毒H3N2侵染的影响

3.1.1基因芯片筛选

3.1.2验证miR-302a的表达

3.1.3 miR-302a参与流感病毒H3N2的复制

3.1.4 miR-302a mimics促进流感病毒H3N2的复制和转录

3.1.5 miR-302a inhibitors抑制流感病毒H3阳的复制和转录

3.2 IRF5为miR-302a的靶标基因

3.2.1生物信息学预测

3.2.2双荧光色素酶检测

3.2.3 IRF5的mRNA表达检测

3.2.4 IRF5的蛋白质水平检测

3.2.5流感H3N2侵染下miR-302a与IRF5的表达

3.31 IRF5基因调控流感病毒H3N2的复制

3.3.1过表达IRF5抑制流感病毒H3N2的复制和转录

3.3.2下调IRF5表达促进流感病毒H3N2的复制和转录

3.4 miR-302a/IRF5对流感病毒介导的宿主免疫反应的影响

3.4.1 IRF5参与流感病毒介导的宿主免疫反应

3.4.2 miR-302a通过调控IRF5参与流感病毒介导的宿主免疫反应

3.5 miR-302a/IRF5对TLR7细胞通路的调控

3.5.1 IRFS参与TLR7而非TLR3细胞通路

3.5.2 miR-302a调控TLR7细胞通路

4讨论

5小结

参考文献

致谢