IRF5调控的肺泡巨噬细胞极化在SAP肺损伤中作用的实验研究

摘要

目的:
　　(1)建立重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤小鼠模型，确定肺损伤程度最严重的时间点。
　　(2)阐明肺泡巨噬细胞极化与SAP肺损伤之间的关系。
　　(3)研究干扰素调节因子5(IRF5)在肺泡巨噬细胞极化调控中的作用。
　　(4)进一步探讨体内实验中慢病毒介导的IRF5干扰(IRF5 shRNA)对SAP肺损伤的干预作用。
　　方法:
　　(1) SAP肺损伤小鼠模型的建立及肺损伤程度的评估:雨蛙素联合脂多糖腹腔注射制备SAP肺损伤小鼠模型，通过胰腺、肺组织病理学评分，血清淀粉酶、肺组织湿干重比(W/D)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)含量、TNF-α和IL-1β检测等方法证实建模成功并进行肺损伤程度评估，进一步确定小鼠肺损伤最严重的时间点。
　　(2)肺泡巨噬细胞极化与SAP肺损伤之间的关系:通过流式细胞技术检测SAP肺损伤小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞及其它炎症细胞的含量。实时定量PCR检测巨噬细胞相关炎症因子TNF-α、IL-1β的含量。通过免疫组织化学染色法及激光共聚焦免疫荧光染色法观察肺泡M1、M2型巨噬细胞浸润与肺损伤之间的关系。
　　(3)研究IRF5在肺泡巨噬细胞极化调控中的作用:通过流式细胞仪分选出肺泡M1、M2型巨噬细胞，实时定量PCR检测IRF5在肺泡M1、M2型巨噬细胞中mRNA水平的表达。IRF5小干扰RNA(IRF5 siRNA)转染肺泡M1型巨噬细胞，通过实时定量PCR、Western blotting检测转染后M1、M2型巨噬细胞标志性分子mRNA水平和蛋白水平的表达，鉴定其极化状态的变化。
　　(4)IRF5 shRNA对SAP肺损伤保护作用的研究:制备慢病毒介导的IRF5干扰病毒，并确定干扰效果最显著的序列作为后续IRF5基因的干扰片段。将IRF5 shRNA通过尾静脉注射感染小鼠，24h后建模，通过肺组织病理学评分，血清淀粉酶、肺组织湿干重比、MPO活性、MDA含量测定、TNF-α、IL-1β检测和免疫组织化学染色法、激光共聚焦免疫荧光染色法等方法评价肺组织损伤程度，检测肺泡巨噬细胞极化状态的改变，评价IRF5 shRNA对SAP肺损伤是否有保护作用。
　　结果:
　　(1)成功建立了SAP肺损伤小鼠动物模型，确定了SAP建模后48h为小鼠急性肺损伤最严重的时间点。
　　(2)肺泡巨噬细胞的极化状态同SAP肺损伤具有密切的联系。肺损伤早期（SAP后24h），此时处于炎症进展期，以M1型肺泡巨噬细胞占据优势;肺损伤后期（SAP后96h），炎症逐渐过渡到修复期，M2型肺泡巨噬细胞数量明显增多。
　　(3) IRF5在肺泡M1型巨噬细胞中的表达量明显高于肺泡M2型巨噬细胞，有显著性差异（P＜0.01）。IRF5 siRNA转染肺泡M1型巨噬细胞后，TNF-α、IL-12、iNOS mRNA相对表达量较未处理M1型巨噬细胞显著降低，有显著性差异（P＜0.01）。IL-10、Arg-1 mRNA相对表达量较对未处理M1型巨噬细胞明显增加，有显著性差异（P＜0.01），与未处理M2型巨噬细胞比较，无统计学意义(P＞0.05)。IRF5 siRNA转染肺泡M1型巨噬细胞后，巨噬细胞极化状态向M2型巨噬细胞转换。
　　(4) IRF5 shRNA组同生理盐水组及Scramble shRNA组比较，肺损伤程度明显减轻。肺泡M1型巨噬细胞明显减少，M2型巨噬细胞显著增多，肺泡巨噬细胞极化状态由M1向M2转换。
　　结论:重症急性胰腺炎建模后48h为小鼠急性肺损伤程度最严重的时间点。肺损伤早期阶段，巨噬细胞以M1极化状态为主，肺损伤修复期M2型巨噬细胞数量明显增多。IRF5是鉴别肺泡M1、M2型巨噬细胞极化状态的重要分子标志之一，是调控肺泡巨噬细胞极化的关键分子。体内实验中，IRF5 shRNA通过促进肺泡M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转换，对重症急性胰腺炎肺损伤具有明显的保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词中英文注释表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 肺泡巨噬细胞在重症急性胰腺炎肺损伤中的作用

1．3 巨噬细胞的极化和功能调节

1．4 干扰素调节因子5与炎症状态下的巨噬细胞极化

1．5 研究目的和研究意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究意义

1．6 研究内容、方法和技术路线

1．6．1 研究内容

1．6．2 研究方法

1．6．3 技术路线

第二章 重症急性胰腺炎肺损伤小鼠模型的建立

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要溶液

2．2．3 主要仪器设备

2．3 实验动物

2．4 方法

2．4．2 重症急性胰腺炎肺损伤小鼠模型的建立方法

2．4．3 胰腺、肺组织病理切片苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)及病理学评分

2．4．4 血清淀粉酶测定

2．4．6 肺组织髓过氧化物酶活性和丙二醛含量测定

2．4．7 肺组织TNF-α和IL-1β测定

2．4．8 统计学分析

2．5 结果

2．5．1 胰腺、肺组织大体形态学改变

2．5．2 胰腺、肺组织镜下病理改变

2．5．3 胰腺与肺组织病理学评分

2．5．4 血清淀粉酶测定结果

2．5．5 肺组织湿干重比测定结果

2．5．6 肺组织MPO活性和MDA含量变化

2．5．7 肺组织TNF-α和IL-1β水平变化

2．6 讨论

第三章 肺泡巨噬细胞极化与重症急性胰腺炎肺损伤

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要仪器设备

3．2．3 实验动物及分组

3．3 方法

3．3．2 肺泡灌洗及炎症细胞计数

3．3．3 肺泡巨噬细胞表型鉴定

3．3．5 免疫组织化学染色法检测肺巨噬细胞浸润情况

3．3．6 激光共聚焦免疫荧光染色

3．3．7 统计学分析

3．4 结果

3．4．1 重症急性胰腺炎肺损伤建模成功后肺的炎症反应

3．4．2 肺泡M1、M2型巨噬细胞分选鉴定

3．4．3 肺组织TNF-α和IL-1β水平变化

3．4．4 CD68免疫组化染色法检测重政急性胰腺炎肺损伤时肺泡巨睡细胞浸润情况

3．4．5 激光共聚焦免疫荧光染色检测重症急性胰腺炎肺组织中M1、M2巨噬细胞的浸润情况

3．5 讨论

第四章 IRF5在肺泡巨噬细胞极化中的作用

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 主要试剂

4．2．2 主要溶液

4．2．3 主要仪器设备

4．2．4 实验动物及分组

4．3 方法

4．3．1 重症急性胰腺炎肺损伤小鼠模型的建立

4．3．2 肺泡灌洗及肺泡M1、M2型巨噬细胞的分选鉴定

4．3．5 实时定量PCR检测SAP早期肺泡巨噬细胞IRF5、IL-12、TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 mRNA的表达

4．3．6 实时定量PCR检测采用IRF5 siRNA沉默IRF5表达后，肺泡巨噬细胞的IRF5、IL-12、TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1的mRNA表达水平

4．3．7 Western blotting检测相关细胞因子IRF5、TNF-α、IL-12、iNOS、Arg-1、IL-10蛋白的表达水平

4．3．8 统计学分析

4．4 结果

4．4．1 肺泡M1、M2型巨噬细胞形态学观察

4．4．2 IRF5在肺泡M1／M2巨噬细胞中的表达

4．4．3 IRF5 siRNA转染肺泡M1型巨噬细胞后，IRF5、TNF-α、IL-12、iNOSmRNA水平明显降低，IL-10、Arg-1mRNA水平明显增高

4．4．4 IRF5 siRNA转染肺泡M1型巨噬细胞后，IRF5、TNF-α、IL-12、iNOS蛋白水平明显降低，IL-10、Arg-1蛋白水平明显增高

4．5 讨论

第五章 慢病毒介导的IRF5干扰对重症急性胰腺炎肺损伤保护作用的研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 主要试剂

5．2．2 主要仪器设备

5．2．3 实验动物

5．3 方法

5．3．2 慢病毒干扰的构建

5．3．3 IRF5 shRNA感染小鼠

5．3．4 胰腺、肺组织切片HE染色及病理学评分

5．3．5 血清淀粉酶测定

5．3．6 肺组织湿干重比测定

5．3．7 肺组织MPO活性和MDA含量测定

5．3．9 免疫组织化学法检测小鼠肺组织IRF5、IL-12、TNF-α蛋白的表达

5．3．10 激光共聚焦免疫荧光染色法检测小鼠肺组织CD68、iNOS、Arg-1的表达

5．3．11 统计学分析

5．4 结果

5．4．1 IRF5干扰序列筛选

5．4．2 IRF5 shRNA干扰后血淀粉酶变化

5．4．3 IRF5 shRNA干扰后肺组织湿干重比测定结果

5．4．4 IRF5 shRNA干扰后肺组织MPO活性变化

5．4．5 IRF5 shRNA干扰后肺组织MDA含量变化

5．4．6 IRF5 shRNA干扰后肺组织TNF-α水平的变化

5．4．7 IRF5 shRNA干扰后肺组织IL-1β水平的变化

5．4．8 肺组织HE染色切片病理学结果

5．4．9 肺组织免疫组化结果

5．4．10 激光共聚焦免疫荧光染色检测肺组织CD68、iNOS、Arg-1的表达

5．5 讨论

第六章 主要结论和展望

6．1 主要结论

6．2 展望

参考文献

综述 转录因子调控的巨噬细胞极化与疾病关系的研究进展

致谢

博士期间已发表和待发表的学术论文

在读期间主持及参与的科研项目