一株极端环境微生物生理特性研究以及菌株鉴定

摘要

从一些极端环境中分离的极端环境微生物(包括嗜碱微生物在内)因适应特殊的生境而具有特殊的生理生化性质,在新菌株的分离、极端酶的克隆和应用、极端环境适应机制研究、结构新颖的活性产物的分离几个方面已经成为重要的生物研究材料。作为具有复杂形态分化和丰富次生代谢产物的生产者,嗜碱放线菌在嗜碱微生物研究中的地位非常重要。HSL10是从新疆盐碱湖环境中分离的菌株。本研究主要内容包括：
　　 ⑴HSL10的生理特性研究。首先确定了进行HSL10培养的最适固体培养基为TSA和GYM,发现在HSL10培养后期可积累黄色色素,可能与菌体生长过程中的次级代谢产物相关；对HSL10的最适生长pH、NaCl浓度耐受性、耐冷性以及抗生素敏感性分别进行了测定。结果表明HSL10具有嗜碱性(最适pH为10)、弱嗜盐性(可在含有0.25 mol／L,NaCl的培养基中生长良好)和耐冷性(在4℃生长良好),且对两种常用抗生素硫链丝菌素和氯霉素敏感,最低选择浓度分别为硫链丝菌素(10μg／mL)、氯霉素(50μg／mL)；制作了该菌在pH10,30℃条件下的生长曲线,以了解HSL10的生长规律。这株菌生长很快,液体培养过程中20小时就达到稳定期。
　　 ⑵HSL10的菌种鉴定。首先用电镜观察HSL10的形态,发现HSL10呈短杆状,无鞭毛；革兰氏染色表明HSL10为革兰氏阳性菌；对HSL10的16S rDNA进行了扩增、克隆和测序。序列分析揭示HSL10为放线菌纲中的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans),与德国菌种保藏中心(DSMZ)的菌株DSM20578(分离自常规陆地环境)100％同源；我们发现DSM20578也具有嗜碱性和耐冷性,这些特性在DSM20578的菌株鉴定文献中未曾报道。为了研究这两株分离自不同环境的微生物是否为同一株菌,我们对两株菌的16S-23S rDNA间区的序列进行扩增、克隆和分析,揭示这两株菌并非完全一样。
　　 ⑶HSL10基因组文库的构建。为了对嗜碱菌HSL10进行功能基因的克隆和研究,我们进行了HSL10的基因组文库的构建:通过HSL10基因组总DNA的提取、末端补平、片段回收、与Cosmid载体连接、包装、转染、筛选重组子等工作,一共获得1920个重组子(对HSL10基因组覆盖率超过99％)；通过随机挑选的重组子进行质粒提取和酶切对文库质量进行检测。检测结果表明文库质粒插入片段均在40Kb左右,说明基因组文库构建成功。
　　 ⑷HSL10基因组上功能基因初步检测。为了研究HSL10是否具有积累天然产物的潜力(其基因组中是否有天然产物合成相关基因,如聚酮合酶、糖基转移酶、糖基合成酶等基因),首先利用这些感兴趣的基因的保守区域序列设计简并引物(或直接利用文献中的引物)进行扩增,在有平行阳性对照的情况下,我们暂未从HSL10基因组上扩增到相应的基因片段；为了研究HSL10是否有积累一些极端酶的能力,我们利用基因组文库筛选和从基因组上直接扩增都没有检测到纤维素酶等基因,但发现HSL10具有明显的β-半乳糖苷酶活性,但常用诱导剂IPTG对其酶活有一定抑制作用,说明其表达调控系统跟大肠杆菌可能存在差异。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 极端微生物

1.2 极端微生物资源开发和利用

1.2.1 极端酶的研究及应用

1.2.2 极端微生物积累天然产物的研究

1.3 嗜碱微生物

1.3.1 嗜碱微生物研究现状

1.3.2 嗜碱微生物资源开发

1.4 本项目的研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 菌株和质粒

2.1.1 本实验中使用的菌株

2.1.2 质粒

2.2 试剂

2.2.1 大肠杆菌质粒提取试剂

2.2.2 电泳缓冲液

2.2.3 抗生素及其他溶液

2.2.4 革兰氏染色试剂

2.2.5 酶和生化试剂

2.3 培养基

2.4 实验方法

2.4.1 大肠杆菌质粒提取

2.4.2 大肠杆菌培养以及常规操作

2.4.3 氧化微杆菌的培养和基因组DNA的提取

2.4.4 一般DNA体外操作

2.4.5 琼脂糖凝胶电泳

2.4.6 PCR产物纯化

2.4.7 革兰氏染色

2.4.8 HSL10生长曲线测定

2.4.9 HSL10基因组文库构建

2.4.10其他

2.5 主要实验仪器

第三章 嗜碱菌HSL10的生理特性研究

3.1 引言

3.2 结果

3.2.1 菌株HSL10培养形态观察

3.2.2 菌株生理生化性质分析

3.2.3 HSL10液体培养生长曲线测定

3.3 讨论

第四章 菌株鉴定

4.1 引言

4.2 结果

4.2.1 显微形态观察

4.2.2 革兰氏染色鉴定

4.2.3 16S rDNA序列分析

4.2.4 16S-23S rDNA间区分析

4.3 讨论

第五章 氧化微杆菌HSL10的基因组文库构建

5.1 引言

5.2 结果

5.2.1 HSL10基因组文库的构建

5.2.2 基因组文库效价的测定

5.2.3 基因组文库质量检测

5.2.4 转化子扩大培养和96孔板保存文库

5.3 讨论

第六章 氧化微杆菌HSL10功能基因初探

6.1 引言

6.2 结果

6.2.1 天然活性产物基因的检测

6.2.2 酶类检测

6.3 讨论

总结和展望

参考文献

硕士期间发表论文

附录1

附录2

致谢