一株高产鼠李糖脂铜绿假单胞菌的鉴定及环境微生物之间的相互拮抗现象的研究

摘要

石油泄漏问题经常与石油化工产业、石油管道运输、石油储藏罐以及海上油轮的运输发生的事故有关。化学合成的表面活性剂通常被用来加快去除这些泄露的原油。然而，大部分的化学表面活性剂大多不能被微生物降解，或部分被降解的产物对动物，植物甚至人类有很大的危害。生物表面活性剂是由生物细胞产生的一种具有表面活性的两性分子，这种分子具有低毒性、稳定、高强度的生物降解性，生态安全性的特质。鼠李糖脂被认为是帮助去除原油污染最有效的生物表面活性剂，它能够有效的乳化石油，加快微生物降解污染的石油。我们从舟山海域油污泥中筛选出一株葡萄糖诱导的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌Zs1。用葡萄糖作为唯一碳源培养Zs1，上清液的乳化指数能达到100％，表面张力能够降低到26.5mN/m。LC-MS/MS分析，Zs1产生19种不同的鼠李糖脂(RL7-11)，其中包括7种单糖的鼠李糖脂，12种双糖的鼠李糖脂。RL7-11相比于SDS在不同的pH、盐度以及温度的条件下具有更强的稳定性。用矿物盐培养基(MSM)加4％葡萄糖30℃，180r/min培养Zs15天，鼠李糖脂的产量达到44g/L。
　　我们在研究中还发现，利用MSM培养基加酵母粉和MSM加葡萄糖为培养基能够富集不同种类的微生物，葡萄糖为唯一碳源时能富集假单胞菌属（Pseudomonas sp），酵母粉为唯一碳源时能富集厦门栖东海菌属（Donghicola sp），芽孢杆菌属（Bacillus sp），产碱杆菌属(Alcaligenes sp)。假单胞菌属分别和厦门栖东海菌属、芽孢杆菌属以及产碱杆菌属在以MSM培养基加酵母粉为唯一碳源条件下共培养时，利用末端荧光标记的限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术和抑菌圈实验的方法证明，假单胞菌属能够抑制厦门栖东海菌属和芽孢杆菌属的生长，而产碱杆菌属能够抑制假单胞菌属的生长。总的来说，我们实验结果初步揭示了不同微生物之间相互拮抗的普遍现象。在原位生物修复过程中，选择适合的微生物对于有效清除环境污染物具有重要的意义。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1．1 海洋石油污染现状

1．1．1 海洋石油污染的原因

1．1．2 海洋石油污染的危害

1．2 海洋石油污染修复方法概况

1．2．1 物理方法

1．2．2 化学方法

1．2．3 生物方法

1．3 鼠李糖脂研究现状

1．3．1 生产鼠李糖脂菌株的发现与筛选

1．3．2 鼠李糖脂的结构及性质

1．3．3 鼠李糖脂生物合成途径

1．3．4 影响鼠李糖脂发酵的因素

1．3．5 发酵液中鼠李糖脂定量方法的研究进展

1．3．6 鼠李糖脂分离方法概况

1．3．7 鼠李糖脂同系物的研究现状

1．3．8 鼠李糖脂应用现状

1．4 铜绿假单胞菌生物降解特性的研究概况

1．4．1 铜绿假单胞菌对正构烷烃的降解特性

1．4．2 铜绿假单胞菌对单苯环物质和多苯环物质的降解特性

1．5 环境微生物相互拮抗研究进展

1．6 T-RFLP分析技术

1．7 研究意义、内容和创新

1．7．1 研究意义

1．6．2 研究内容

1．6．3 创新之处

第二章 铜绿假单胞菌Zs1的筛选与鉴定

2．1 材料与仪器

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 矿物盐培养基(MSM)配方

2．1．4 LB培养基配方

2．2 实验方法

2．2．1 样品处理及富集培养

2．2．2 富集菌株的保存

2．2．3 T-RFLP对菌株富集培养的分析

2．2．4 单菌落16S rDNA PCR

2．2．5 单茵落16S rDNA测序分析绘制进化树

2．3 结果与讨论

2．3．1 16S rDNA PCR及T-RFLP

2．3．2 进化树的构建确定菌种类型

2．4 本章小结

第三章 Zs1乳化活性及石油降解活性的测定

3．1 材料和仪器

3．1．1 主要实验试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．2 Zs1生长曲线的测定

3．2．3 Zs1降解油活性的测定

3．2．4 荧光定量PCR

3．2．5 扫描电镜和透射电镜观察细胞特征

3．3 结果与讨论

3．3．1 排油圈和E24

3．3．2 生长曲线与表面张力曲线

3．3．3 鼠李糖脂产量的测定

3．3．4 不同葡萄糖浓度的生长曲线及乳化活性

3．3．5 荧光定量PCR

3．3．6 电镜观察结果

3．3．7 Zs1降解油的活性

3．4 本章小结

第四章 鼠李糖脂的化学分析

4．1 材料与仪器

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 鼠李糖脂的提取与纯化

4．2．2 琼脂免疫扩散共沉淀实验

4．2．3 TLC薄层层析

4．2．4 RL7-11的LC-MS／MS分析

4．2．6 RL7-11和SDS不同浓度溶液的表面张力测定以及E24实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 琼脂免疫扩散共沉淀实验

4．3．2 RL7-11的TLC及LC-MS／MS分析

4．4 本章小结

第五章 微生物之间相互拮抗现象的研究

5．1 主要试剂和仪器

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 T-RFLP分析不同营养条件微生物种类

5．2．2 混合菌株的生长曲线及排油圈实验

5．2．3 分离两种培养条件下的菌株

5．2．4 纯化的菌株在两种营养条件下的生长情况

5．2．5 不同菌株之间相互拮抗关系的确定

5．2．6 优势菌株发酵产物的抑菌圈实验

5．3 结果与讨论

5．4 本章小结

6．1 结论

6．2 展望

作者简介

附录

参考文献