水稻SBPase酶的表达纯化酶学性质研究及蓝藻FBPase/SBPase为靶标的抑制剂筛选

摘要

景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)存在于高等植物中的一种重要的调控酶，作用于光合作用暗反应的再生阶段中，将景天庚酮糖-1，7-二磷酸水解成景天庚酮糖-7-磷酸和一个磷酸分子。它只存在于植物的叶绿体中，在动物细胞中没有这种酶的存在，是一种潜在的绿色除草剂靶标。对SBPase酶结构、功能及催化机理的研究有助于我们进行以SBPase为靶标的除草剂的创制研究。
　　 近年来由于湖泊富营养化程度的日益严重，各地频繁爆发水华污染水域事件。蓝藻是引起水华的元凶。果糖-1，6-/景天庚酮糖-1，7-二磷酸双功能(FBP/SBPase)是蓝藻光合作用暗反应中重要的调控酶，是潜在的杀藻剂的靶标酶。
　　 本文主要开展了以下四个方面的研究工作:
　　 (1) Ri-SBPase的表达纯化:构建一系列表达载体:PGEX-SBPase，PET-SBPase，pMAL-C2X-SBPase，和pColdⅡ-SBPase。研究发现pColdⅡ为表达载体PG-TF2/BL21为表达宿主菌可以获得可溶性好、活性较高的SBPase。
　　 (2)酶学性质的研究:在得到具有高活性、可溶的Ri-SBPase后，本文对该酶的酶学性质进行了分析:获得了Km为0.51±0.04mM，Vmax为16.098U/mg，最适pH为8.5，最佳反应温度37℃，以及金属Mg2+离子Ka为4.63±0.36mM。
　　 (3)以SBPase为靶标的抑制剂筛选:对实验室已有的化合物库（共9个系列240个化合物）进行高通量筛选，获得具有较高活性的抑制剂D13-tqd151和D13-tqd152， IC50分别是的值45±3.28μM和4.45±0.71μM。
　　 (4)以蓝藻FBP/SBPase双功能酶为靶标，对本课题组合成和计算机虚拟筛选的化合物（共140个化合物）进行了高通量筛选，其中具有较高抑制活性的D13-tqd95, D13-tqd94, D13-tqd96, D13-tqd176, D13-tqd175, D13-tqd195,D13-tqd162，D13-tqd198的IC50值分别是10.09±2.66μM，10.66±3.24μM，17.65±1.43μM,11.49±0.15μM,3.03±1.12μM,11.24±0.81μM,0.45±0.05μM。构效关系分析发现，在这一系列以色酮苯甲酰腙为骨架的化合物中，当苯环上的氢被溴原子取代后获得更好的抑制效果。

目录

声明

摘要

第一章 研究概述

1．1 重组蛋白在大肠杆菌中的异源表达

1．1．1 比较常见的几种融合蛋白标签的介绍

1．1．2 E．coli表达系统

1．2 Ri-SBPase和Cy-SBPase／FBPase的研究背景

1．2．1 Ri-SBPase的研究背景

1．2．2 Cy-SBPase／FBPase的研究背景

1．3 本文立题思想

第二章 水稻景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的表达纯化研究

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要实验药品

2．1．3 实验用到的质粒和菌株

2．1．4 实验溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 质粒的提取与序列鉴定

2．2．2 大肠杆菌感受态制备

2．2．3 质粒的转化

2．2．4 蛋白质SDS-PAGE的分析

2．2．5 聚合酶链式反应

2．3 GST-RiSBPase的构建及表达纯化

2．3．1 pGEX-5X-RiSBPase的构建及表达纯化

2．3．2 pGEX-6P-RiSBPase／BL-21构建及表达纯化

2．4 His-RiSBPase表达系统的构建及表达纯化

2．4．1 pET-30a-RiSBPase／BL-21的表达系统的构建及表达纯化

2．4．2 pET-30a-RiSBPase／BL-21的表达

2．4．3 pET-30a-RiSBPase／BL-21的纯化

2．5 pMAL-C2X-RiSBPase／TB1构建和表达纯化

2．5．1 pMAL-C2X-RiSBPase／TB1的构建

2．5．2 pMAL-C2X-RiSBPase／TB1的表达

2．5．2 pMAL-C2X-RiSBPase／TB1的纯化

2．6 pcold Ⅱ-RiSBPase／PG-TF2／BL21的构建和表达纯化

2．6．1 pCold Ⅱ-RiSBPase／PG-TF2／BL21构建

2．6．2 pCold Ⅱ-RiSBPase／PG-TF2／BL21的表达

2．6．3 pCold Ⅱ-RiSBPase／PG-TF2／BL21的纯化

2．7 实验结果与讨论

2．7．1 pGEX-5X-RiSBPase／BL-21，pGEX-6P-RiSBPase／BL-21构建

2．7．2 pGEX-5X-RiSBPase／BL-21，pGEX-6P-RiSBPase／BL-21的蛋白表达

2．7．3 pET-30a-RiSBPase／BL-21的构建和表达纯化

2．7．3 pMAL C2X-RiSBPase／TB1的构建和表达纯化

2．7．4 pCold Ⅱ-RiSBPase／PG-TF2／BL21的构建和蛋白表达纯化

2．8 本章小结

第三章 水稻SBPase酶动力学性质的研究

3．1 实验材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 蛋白含量测定

3．2．2 酶活性的测定

3．2．3 Ri-SBPase最适pH的研究

3．2．4 Ri-SBPase最适反应温度的研究

3．2．5 Ri-SBPase镁离子Ka的研究以及其他金属离子对其活性的影响

3．2．6 Ri-SBPase最适DTT浓度的研究

3．2．7 Ri-SBPase底物Km的研究

3．2．8 Ri-SBPase底物选择性

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 重组水稻景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的表达纯化

3．3．2 Ri-SBPase酶学性质的研究

3．4 本章小结

第四章 以Ri-SBPase为靶酶的抑制剂筛选

4．1 引言

4．2 试验材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．3 试验方法

4．3．1 抑制剂的初步筛选

4．3．2 高抑制率化合物对Ri-SBPase的IC50的测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 化合物初筛结果

4．4．2 高抑制率化合物的IC50的测定结果

4．5 本章小结

第五章 以蓝藻FBP／SBPase为靶酶的抑制剂筛选

5．1 引言

5．2 试验材料

5．2．1 主要仪器

5．2．2 主要试剂

5．3 试验方法

5．3．1 化合物初筛

5．3．2 高抑制率化合物对水稻SBPase的IC50的测定

5．4 结果与讨论

5．4．2 高抑制率化合物的IC50的测定结果

5．5 本章小结

全文总结

参考文献

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢