PI3K-Akt和JNK信号通路与AfMNPV诱导斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡

摘要

细胞凋亡是由胞内基因控制的程序死亡过程，即多细胞生物在生理或病理条件下，经过多途径的信号传导作用而启动内部机制，结束其自身生命的过程。目前人们对于细胞凋亡途径的研究已经进行了一个漫长的过程，由于细胞中的信号转导通路在细胞周期、增殖分化与凋亡以及多种生命活动中的重要调节作用亦愈来愈受人重视，因此关于细胞凋亡与细胞信号转导通路间的关系的研究也相继开展起来。JNK信号转导通路是MAPK通路的一重要分支，或称为应激活化蛋白激酶，它在细胞周期、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用;PI3K信号通路通过参与多种细胞生命活动尤其是调节肿瘤细胞的增殖和存活而受到人们的重视，其中AKT也称为蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效应物，活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶或转录因子来调节细胞的功能。
　　关于以上所述的细胞凋亡与细胞信号转导通路关系的研究基本是在哺乳动物细胞中展开，本实验室长期从事昆虫细胞凋亡的研究，前期的实验已经证实了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程中涉及到线粒体凋亡途径，细胞色素C从胞间质释放到胞质中后引起下游的一系列复杂的凋亡级联反应。本实验拟在此基础之上，探究JNK和PI3K-AKT信号通路与AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程间是否也存在某种联系。
　　SP600125和Wortmannin分别是JNK和PI3K-AKT信号通路的特异性抑制剂，实验之前我们对实验细胞SL-1进行了两种抑制剂的耐受性实验，发现SP600125和Wortmannin在浓度低于50μM时，对SL-1的生长基本无毒害用。首先为了更好地了解SL-1细胞在各种条件下的细胞动力学过程，实验中采用血细胞板法计数细胞，绘制它的生长曲线，发现正常培养条件下的SL-1细胞成简单的“S型”生长，当分别加入这两种最适浓度的抑制剂SP600125(2.5μM)和Wortmannin(0.5μM)培养细胞后，SL-1的生长趋势不变，因此后续实验中的抑制剂也是采用这两种浓度。在荧光显微镜下从形态学上定性的观察DAPI染色的SL-1细胞，发现经SP600125和Wortmannin分别处理的AfMNPV诱导后的SL-1细胞，凋亡小体明显减少;流式细胞术定量的测量细胞凋亡率的结果与之一致，抑制剂组的细胞凋亡程度明显较病毒组低，因此初步可以判定JNK和PI3K信号通路参与了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程。
　　接下来研究采用caspase-3酶活的测定以及Western Blot方法检测凋亡相关蛋白的表达，试图探究JNK和PI3K-AKT信号通路如何影响AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡过程。实验结果表明，AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡后，caspase-3酶活增强且被活化切割成17KD片段，启动了下游的凋亡事件，但是当分别或同时加入抑制剂SP600125和Wortmannin后，caspase-3的切割大幅度减弱，凋亡程度明显被抑制，其中同时使用两种抑制剂的效果和单独使用抑制剂时区别不大。于是对凋亡上游事件细胞色素C的变化情况进行检测，和预测结果一致，在加入抑制剂SP600125和Wortmannin后胞质中细胞色素C含量显著下降，这就说明在AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的起始阶段，JNK和PI3K信号转导通路即被活化参与到整个凋亡进程中。
　　在哺乳动物细胞中发现编码JNK的基因jnk1、jnk2、jnk3，其相应的编码产物JNK1和JNK2广泛存在于各组织中，当JNK通路被激活，相应的蛋白JNK1和JNK2会发生磷酸化进而发挥功能。当用免疫印迹杂交的方法检测JNK1/2和PI3K的关键效应物AKT蛋白的表达情况，发现AfMNPV是通过磷酸化JNK1/2和AKT来分别激活了JNK和PI3K-AKT信号通路并且影响了SL-1细胞周期，但是所有这些蛋白的磷酸化程度在分别加入SP600125和Wortmannin后相应的减弱。实验结果显示无论是被活化切割的caspase-3蛋白还是JNK和PI3K信号通路的效应物P-JNK1/2和P-AKT，蛋白含量都随病毒诱导凋亡时间的延长而增加。
　　因此初步可以得出结论，JNK和PI3K-AKT信号通路通过活化JNK1/2和AKT蛋白而参与到AfMNPV诱导的SL-1细胞凋亡过程中，协同调节各种凋亡反应并且影响细胞周期的改变。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 细胞凋亡概述

1．1．1 细胞凋亡概念与特征

1．1．2 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶Caspase与细胞凋亡

1．1．3 细胞凋亡信号通路

1．1．4 细胞凋亡的检测

1．2 JNK信号转导通路

1．2．1 JNK信号转导通路概要

1．2．2 JNK信号转导通路与细胞凋亡

1．3 PI3K／AKT信号转导通路

1．3．1 PI3K／AKT信号通路组成及活化

1．3．2 AKT简介

1．3．3 PI3K-AKT信号转导通路与细胞凋亡

1．4 研究的目的和意义

2．实验材料和方法

2．1 材料

2．1．1 昆虫细胞和病毒

2．1．2 主要药品与试剂

2．1．3 主要溶液的配制

2．1．3 主要的仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 病毒液制备与病毒滴度测定

2．2．3 病毒诱导细胞凋亡

2．2．4 AfMNPV和抑制剂共同处理细胞

2．2．5 SL-1生长曲线的测定

2．2．6 细胞凋亡的DAPI染色

2．2．7 细胞凋亡的流式细胞仪定量检测

2．2．8 细胞凋亡的Caspase-3酶活力测定

2．2．9 细胞质蛋白的提取

2．2．10 蛋白质免疫印记

2．2．11 细胞周期的测定

3．实验结果

3．1 SL-1细胞生长曲线的建立

3．2 AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡

3．2．1 AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的形态学观察

3．2．2 流式细胞术定量检测AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡

3．3 AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡后胞质中细胞色素C含量的变化

3．4 AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡后caspase-3酶活测定和含量变化的检测

3．5 PI3K-AKT和JNK两种信号通路参与AtMNPV诱导SL-1细胞凋亡

3．6 PI3K-AKT和JNK两种信号通路参与调节AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡周期变化

4．讨论

参考文献

致谢