家蝇细胞色素P450介导抗性机制的研究

摘要

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系，它能够代谢多种内源性物质和外源性物质，因其生物学的重要性，一直是生物学领域研究的一个重要对象。家蝇(Eusca domestica)是一种在世界范围内普遍发生的重要的公共卫生害虫，可以传播60多种人和动物的肠道疾病。有效地消灭家蝇，对于控制许多重要疾病的传播，保证人类健康具有重要意义。为深入研究家蝇细胞色素P450的抗性机制，我们就家蝇细胞色素P450方面的工作开展了研究，主要研究结果如下： 利用试验室汰选的拟除虫菊酯类抗性品系家蝇(ISO、BSR)用点滴法测定了抗性家蝇对增效剂的增效作用和对几种杀虫剂的交互抗性作用，结果表明：ISO的抗性倍数为492，增效倍数为30；BSR的抗性倍数为567，增效倍数为64倍。二氯苯醚菊酯和溴氰菊酯之间存在较高程度的交互抗药性；拟除虫菊酯抗性较高的家蝇对作用机制不同的新农药(多杀菌素、氟虫腈)表现较低程度的交互抗性。 测定了家蝇细胞色素P450含量和b<,5>含量。结果显示抗性品系的P450含量和b<,5>含量都要高于敏感品系；选择了细胞色素P450的两种目标底物(对硝基苯甲醚、甲氧基试卤灵)。分别对其进行了活性测定，结果表明P450对两种底物都有活性，且抗性家蝇的酶活性要高于敏感家蝇。 根据细胞色素P450血红素结合区的保守序列，设计了8条P450特异性引物，应用基于mRNA差异显示(mRNA differential display RT-PCR)的基因分离技术，采用mRNA差异显示技术初步分析了敏感和对溴氰菊酯产生抗性家蝇品系中差异表达的细胞色素P450基因，结果从抗性品系中分离出两个在抗性家蝇品系中过量表达的细胞色素P450基因(M1,M2)，这两基因在抗性家蝇体内的表达量明显高于敏感品系，其中M1分别与家蝇中的CYP6A24和CYP6A1在氨基酸水平上具有59％和58％的相似性，M2分别与家蝇中的CYP6A24和CYP6A1在氨基酸水平上具有39％和51％的相似性。

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第一章 文献综述

1细胞色素P450酶系与细胞色素P450

1.1细胞色素P450酶系

1.2细胞色素P450

1.3细胞色素P450的基因

1.4 P450的多样性

2昆虫P450酶系的重要功能

2.1 P450酶系催化内源性物质代谢

2.2 P450酶系催化外源性物质代谢

3 P450酶系在农药学研究中的意义

3.1 P450酶系与害虫抗药性

3.2 P450酶系与农药对高等动物的毒性

3.3 P450与新农药创制

4家蝇细胞色素P450

4.1家蝇P450基因

4.2 P450与家蝇抗药性

5 mRNA差异显示技术

5.1 mRNA差异显示技术的原理

5.2 DDRT-PCR技术的优缺点及改进

6本研究的立题依据及主要研究内容

第二章 家蝇对杀虫剂交互抗性的测定及增效作用的研究

1材料与方法

2结果与分析

2.1两个抗性品系的抗性水平和增效水平：

2.2两个抗性品系的交互抗性水平：

2.2抗性品系对新农药的交互抗性：

3讨论

第三章 P450、b5含量和酶活性测定

1材料与方法

2结果与分析

2.1 细胞色素P450含量的测定

2.2 细胞色素b5含量的测定

2.3细胞色素P450和b5含量的测定比较

2.4对硝基苯甲醚0-去甲基活性测定

2.5甲氧基试卤灵0-脱甲基活性

2.6对硝基苯甲醚0-去甲基活性和甲氧基试卤灵0-脱甲基活性比较

3讨论

第四章 抗性家蝇细胞色素P450基因克隆

1材料与方法

2结果与分析

2.1家蝇组织中总RNA提取

2.2 mRNA差异显示分析

2.3目标片段的再次扩增

2.4 差异片段的序列分析

3讨论

参考文献

致谢

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