检测结核分枝杆菌CFP10-ESAT6分泌蛋白的方法建立和应用研究

摘要

目前在人类和动物的传染病中，结核病仍是危害人畜健康的最严重的传染性疾病。结核病的诊断技术主要有细菌学，免疫学和分子生物学三种诊断方法，其中细菌学检查仍然是结核病实验室诊断的金标准。但该法涂片阳性率低，细菌培养费时间；分子生物学检查虽然快速，灵敏，但操作烦琐，技术要求高，难以广泛运用。免疫学检查的诊断价值虽然不如细菌学检查，但具有简便，快速，又有一定的敏感性和特异性，因此不失为结核病有效诊断的辅助方法。近年来，人们对结核分枝杆菌(MTB)培养的滤液进行了深入的研究，分离出了多种分泌蛋白，如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10、ESAT6等。其中的CFP10、ESAT6具有良好的免疫原性，而且为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有，BCG及非致病分枝杆菌缺乏。因此这两种蛋白有利于区别是否是卡介苗接种过的病畜，是许多研究人员所研究的对象。该研究以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板，经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT6融合基因片段，克隆于pET21a表达载体中，获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT6，将其转化大肠杆菌BL21细胞，经IPTG诱导表达，得到了25ku的目的蛋白。Western blot分析重组蛋白的特异性。此后表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔，通过ELISA方法检测抗体效价水平，高效价抗体用DEAE-32阴离子交换柱纯化后，一部分抗体为包被所用，另外一部分的抗体用辣根过氧化物酶标记后作为检测用，建立双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清和341份临床血清标本的检测，确定该方法的可行性。 结果表明：成功构建了CFP10-ESAT6融合基因的原核表达质粒，获得了CFP10-ESAT6融合蛋白。estern blot分析表明，重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应，与健康者血清不发生反应。再以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。抗CFP10-ESAT6多克隆抗体的效价在1:16000稀释后OD<,450>值基本上都达到1.0左右。在纯化和酶标记后，分别以1:1000为包被工作浓度，1:3000为酶标工作浓度时，CFP10-ESAT6的最低检出浓度为25ng/ml，CFP10-ESAT6检测17种分枝杆菌培养上清只有结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌结果为阳性。在与血清反应时的敏感性和特异性分别为40.1％，99.2％。 该研究在成功地表达了CFP10-ESAT6融合蛋白的基础上，以结核特异性蛋白免疫兔子获得高效价抗体，建立了双抗体夹心法，该方法对于结核杆菌血清学诊断是切实可行的方法。

目录

文摘

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论文说明：缩略语表

声明

第一章结核分支杆菌分泌蛋白的诊断应用研究进展

1结核病流行现状和特点

2结核分支杆菌主要分泌蛋白的研究进展

2.1分泌性蛋白的研究概况

2.2目前结核杆菌主要分泌蛋白的特性研究

3.结核分支杆菌有关蛋白的免疫诊断检测的研究进展

3.1传统的结核菌素皮内变态反应（OT，PPD）

3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）

3.3 γ-干扰素试验

3.4淋巴细胞增生试验

3.5免疫过氧化物酶

4.结语

第二章：结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆、表达和纯化

前言

1材料

1.1主要材料和试剂

1.2部分溶液的配制

1.3主要仪器设备

2实验方法

2.1引物设计

2.2 DNA的提取

2.3 CFP10和ESAT6基因片段的获得

2.4 CFP10-ESAT6融合基因的获得

2.5基因片段的纯化与回收

2.6测序载体的构建

2.7目的基因在大肠杆菌中的高效表达

2.8 Western blot免疫印迹反应鉴定表达产物

2.9目的蛋白的纯化

2.10重组蛋白的浓度和含量的测定

3.结果

3.1目的基因的扩增结果

3.2 CFP10-ESAT6融合基因片段扩增结果

3.3表达载体pET21a-CFPI0-ESAT6酶切电泳图

3.4重组蛋白的表达

3.5目的基因表达产物的Western blot分析结果

3.6目的基因表达条件的优化

3.7目的蛋白表达形式的分析

3.8重组蛋白的纯化

3.9蛋白含量的确定

4讨论

第三章CFP10-ESAT-抗体的制备及检测方法的建立和应用

1材料

1.1主要材料及试剂

1.2标本来源

1.3实验动物

1.4主要试剂及培养基配置

1.5主要仪器

2方法

2.1 CFP10-ESAT6多克隆抗体的制备

2.2应用ELISA方法检测血清中CFP10-ESAT6抗体效价

2.3抗CFP10-ESAT6抗体的纯化

2.4辣根过氧化物酶的标记

2.5双抗体夹心法工作条件的确定

2.6双抗体夹心法敏感性的确定

2.7双抗夹心法敏感性实验

2.8临床标本的鉴定

3结果

3.1兔血清中抗体效价的测定

3.2抗CFP10-ESAT6抗体的纯化就结果

3.3双抗体夹心法工作浓度的确定

3.4敏感性的确定

3.5双抗夹心法与结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌上清培养物的鉴定

3.6临床标本检测

4.讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历