基于GO@Fe3O4@Pt纳米复合物和滚环扩增协同放大策略的生物传感器快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64

摘要

目的　　结核病是由结核分枝杆菌感染引起的疾病，具有较高的发病率和死亡率。传统的检测方法灵敏度低，耗时长，无法满足临床需求。因此急需建立一种快速检测新方法以期能为临床早期诊断结核病提供可靠的实验室依据。本研究拟通过整合GO@Fe3O4@Pt纳米复合物和滚环扩增的协同放大效应，构建全新的电化学生物传感器，实现对血液中结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的快速灵敏检测。在优化新建传感器关键参数基础上，对其分析性能进行评价。　　方法　　1. 合成GO@Fe3O4@Pt纳米复合物：首先，在EDC/NHS介导下通过酰胺化合成GO@Fe3O4；然后，再加入氯铂酸，用NaBH4原位还原Pt4+合成GO@Fe3O4@Pt纳米复合物。通过透射电子显微镜对其形态进行表征，通过能谱仪进行化学组成表征。　　2. 合成环状DNA：将引物和磷酸化的锁式探针混合，于95℃变性5 min，逐步降温至22℃。加入适量的T4 DNA连接酶，22℃过夜，合成环状DNA。用核酸外切酶I、核酸外切酶III去除非环状的单链DNA和错配的双链DNA。用乙醇沉淀法纯化环状DNA，并用琼脂糖凝胶电泳表征环状DNA的合成情况。　　3. 构建生物传感器：蛋白G通过金-组氨酸键固定到金电极表面，捕获抗体通过蛋白G与其Fc段特异结合固定；BSA用于封闭金电极；当MPT64存在时，适配体-引物可以结合到金电极表面，并引发滚环扩增反应得到大量长的单链DNA。GO@Fe3O4@Pt通过π-π键与单链DNA结合后，催化工作液中的底物H2O2分解，产生电化学信号，从而实现对MPT64的定量检测。　　4. 优化实验条件：筛选适配体-引物，对蛋白G、捕获抗体、适配体-引物的浓度和滚环扩增反应时间以及工作液的pH值等关键因素进行优化，以提高生物传感器的信噪比。　　5. 生物传感器的分析性能评价：通过测定不同浓度的MPT64，对传感器重复性、特异性、线性范围、最低检测线、稳定性进行评价。　　6. 回收实验：将MPT64蛋白添加到血清中，形成不同浓度的MPT64血清溶液，用构建的传感器进行分别检测。　　结果　　1. GO@Fe3O4@Pt纳米复合物的表征：透射电子显微镜观察发现Fe3O4、Pt成功修饰到GO表面；能谱仪分析表明存在本纳米复合物的主要元素（C、O、Fe、Pt）。　　2. 滚环扩增结果：琼脂糖凝胶电泳发现，加入T4 DNA连接酶后，电泳条带增多且主条带位置改变。核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ处理后，仅留下环状DNA。滚环扩增后因产物分子量大，电泳条带位于上样孔附近，表明成功合成环状DNA并用于滚环扩增。　　3. 实验条件的优化：筛选得到高亲和力的适配体-引物（APP2）。关键参数的最佳条件分别为：蛋白G的浓度为15 μg?mL-1，捕获抗体的浓度为20 μg?mL-1，适配体-引物的浓度为200 nmol?L-1，滚环扩增反应时间为60 min，工作液的pH值为4.0。　　4. 生物传感器的分析性能评价：重复测量MPT64，相对标准偏差分别为3.66%、3.76%、2.60% （n=10，浓度分别为1.0 × 102 fg?mL-1, 1.0 × 104 fg?mL-1, 1.0 × 106 fg?mL-1）。该方法特异性好，仅对MPT64蛋白产生明显电流响应。线性范围为5.0 fg?mL-1~1.0×106 fg?mL-1；最低检测线为0.34 fg?mL-1。生物传感器在4℃存储5天、10天、15天后，测得的电流信号是初始电流信号的97.31%、95.21%、90.23%。　　5. 回收实验：在血清中加入MPT64，得到三个不同浓度的MPT64溶液（10 fg?mL-1 ，1.0×103 fg?mL-1，1.0×105 fg?mL-1），经检测其回收率分别为97.97%、106.5%、98.95%。　　结论　　本研究成功构建了基于GO@Fe3O4@Pt纳米复合物和滚环扩增协同放大策略的生物传感器。该传感器具有较宽的线性范围，灵敏度高，特异性好，并可用于检测血液样本中的MPT64。该方法可在4小时内完成对MPT64的检测，将为结核病的及时诊断提供快速有利的实验室支持。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 实验方法

2.1 GO@Fe3O4@Pt纳米复合物的合成及表征

2.2 GO@Fe3O4@Pt纳米复合物催化活性稳定性验证

2.3 GO@Fe3O4@Pt纳米复合物吸附单链DNA可行性验证

2.4 环状DNA的合成

2.5 初步构建生物传感器检测MPT64

2.6 实验条件优化

2.7 生物传感器分析性能评价

2.7.1 重复性

2.7.2 特异性

2.7.3 线性范围和最低检测线

2.7.4 回收实验

2.7.5 稳定性

3 结果与讨论

3.1 纳米复合物的表征

3.2 滚环扩增的验证

3.3 生物传感器构建过程的表征

3.4 实验条件优化

3.5 生物传感器的分析性能评价

3.5.1 重复性

3.5.2 特异性

3.5.3 线性范围和最低检测线

3.5.4 回收实验

3.5.5 稳定性

全文总结

参考文献

文献综述:结核分枝杆菌检测技术的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表论文