茶黄素的酶促合成、分离鉴定及功能研究

摘要

茶黄素是指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质，由茶多酚(主要是儿茶素类及其衍生物)在多酚氧化酶存在下氧化缩合而来。红茶中茶黄素的含量约为0.5％～3％，但茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种药理功能与保健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌等，在某些功能方面甚至优于儿茶素。红茶茶黄素类物质的研究与开发是继茶多酚、儿茶素之后近年来兴起的又一热点，不仅具有重要的理论价值，而且在天然药物、保健品、化妆品和日化用品等领域具有广阔的产业化前景。但是，茶黄素的化学研究不能满足医药领域研究的要求，如茶黄素的提纯难度较大、性质欠稳定等限制了药用研究的深入。所以，到目前为止，茶黄素提制的产业化工艺技术尚不成熟，表现为产品纯度低、成本高、产能低，严重阻碍了以茶黄素为原料的天然药物及功能性食品的研究开发。同时，由于结构的相似性，茶黄素类物质单体的分离非常困难，直接从红茶中分离茶黄素单体更加困难。由于红茶中茶黄素的含量低，依靠红茶为原料来提制茶黄素成本过高，必须研究如何采用儿茶素为原料，筛选特异多酚氧化酶酶源，利用酶促氧化合成茶黄素，研究茶黄素合成机理，具有重要的理论与实际意义。因此，本研究设计了一种利用植物或微生物多酚氧化酶氧化儿茶素混合物体外合成茶黄素复合物的方法。并通过调控底物儿茶素的组成比例来调控氧化产物中茶黄素各组分的组成比例。采用聚酰胺柱色谱结合制备液相色谱、高速逆流色谱，对茶黄素复合物进行分离，拟得到4种茶黄素单体，其化学结构由HNMR，C NMR，UV，IR和MS表征。并采用高通量筛选模型对茶黄素单体的降血脂、抗炎和抗肿瘤活性方面进行了系统深入的研究。 1. 多酚氧化酶的优选及合成茶黄素的研究 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术，研究了不同来源(茶叶、苹果、梨、蘑菇和漆酶)的多酚氧化酶同工酶的酶带特征。结果表明，不同来源多酚氧化酶同工酶具有相似的酶带，但对酶带数目、Rf值及分子量均存在种间差异。梨有11条同工酶带，苹果4条，茶叶有5条，蘑菇5条，而漆酶只有1条。PPO同工酶带Rf值集中于0.40～0.70的区间内。茶叶多酚氧化酶同工酶的相对分子量大于94 000，而梨、苹果、蘑菇和漆酶多酚氧化酶同工酶的相对分子量介于45000～94 000。同时研究了多酚氧化酶活性和同工酶组成对茶黄素合成的影响。 合成茶黄素能力大小顺序为：梨PPO，茶叶PPO，微生物PPO，苹果PPO，漆酶PPO，蘑菇PPO。其中，在所有梨品种中，丰水梨果实多酚氧化酶同工酶谱带最多，酶活性最大，合成茶黄素的能力最强。 2. 茶黄素的酶催化合成 利用丰水梨果实多酚氧化酶，在单因素试验基础上，设计正交试验，进行酶性合成茶黄素，研究儿茶素组成、浓度和理化条件对茶黄素合成的影响，以确定最佳合成条件。结果表明，可以通过氧化不同儿茶素组成比例的底物来调控氧化产物中茶黄素各组分的组成比例。以儿茶素混合物C(EGC>200 mg/g，EGCG>200mg/g，儿茶素总量>500 mg/g)为材料，茶黄素酶促合成的最佳条件为：反应体系的最佳pH值为5.5，温度为30℃，底物浓度为5 mg/ml，酶添加量为49162.50U，最佳反应时间40 min。pn值和儿茶素浓度是反应体系中两个重要的影响因子(P<0.05)。应用多元线性回归模型，研究了儿茶素混合物C酶性氧化参数对制备茶黄素复合物的综合效应，以茶黄素为目标，建立了儿茶素混合物C酶促氧化制备茶黄素复合物的参数模型，即Y=-23.758+2 1.359X<,1>-0.683X<,2>-1.841X<,3>(Y：茶黄素总量，X<,1>：pH，X<,2>：温度，X<,3>：儿茶素底物浓度)。根据回归模型，并结合各单因素试验，综合优化方案与上述正交实验结果相吻合。 3. 茶黄素单体的分离及结构鉴定 用高速逆流色谱分离纯化茶黄素，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸(1：5：1：5：0.25，v/v/v/v/v)为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速为2mL/min，仪器转速700 r/min，进样量30 mg。尤其使得两种茶黄素同分异构体(茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯)达到较好的分离。从茶黄素粗提物中分离纯化得到茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯。经高效液相色谱分析，纯度分别为94.2％，95.8％，93.7％和96.4％。其化学结构由<'1>H NMR，<'13>C NMR，UV，IR和MS鉴定。 用制备型反相高效液相色谱结合聚酰胺柱色谱对茶黄素提取物进行了制备分离。色谱柱为PRC-ODS C<,18>(20.0mm×250mm i.d.，10um)，流动相为ACN-EtOAc-2％HAc(21：3：76,v/v)，检测波长280 nm，流速15 mL/min，进样量400μl(30 mg/ml)。在此条件下分离得到4个单体化合物，经理化反应和光谱分析(HPLC、HPTLC、UV、IR、MS、NMR)分别鉴定为茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯。经高效液相色谱分析，纯度分别为96.9％，98.8％，95.9％和98.9％。 采用聚酰胺为分离材料，对茶黄素及红茶酚性色素进行高效薄层色谱分离。结果表明，展开剂为甲醇-三氯甲烷(1：1，v/v)，二次展开，四种主要茶黄素类物质达到基线分离，可进行茶黄素的定性定量分析。本实验采用二次展开分离红茶乙酸乙脂层酚性色素，第一次在甲醇-醋酸(1：1，v/v)体系中展开，然后在甲醇-丙酮-甲酸(2：1：1，v/v)体系中二次展开，茶黄素类物质和儿茶素类物质可以达到分离。根据对照品的光谱特性和Rf值，分别鉴定为茶黄素-3,3’-双没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯和茶黄素、EGCG、ECG和EC。 4. 茶黄素降血脂、抗炎、抗肿瘤活性的高通量筛选 首次应用PPARs、FXR、LXR、TNFα、IL-1、SGC-7901、A549、K562、HepG2为靶点的高通量筛选模型，研究茶黄素的降血脂、抗炎、抗肿瘤活性。结果表明，TFs在LXR受体上呈现微弱的活性，激活倍数为1.55，其次是TFDG，其激活顺序为：TFs>TFDG>TF3G≈TF>TF3’G。TF、TF3G、TF3’G和TFDG及TFs都呈现出微弱的激活FXR受体的活性，其激活顺序为：TFDG>TF3’G≈TF3G>TF>TFs；TFDG的激活效果最佳，激活倍数达2.35，其次是TF3’G，激活倍数达2.22，激活作用明显。TFDG和TFs样品有增加FXR受体敏感性的作用。茶黄素单体(TF、TF3G、TF3’G和TFDG)及茶黄素混合物(TFs)在TNFα和IL-1分泌抑制模型上抑制活性不显著。TF、TF3G、TF3’G和TFDG及TFs在高浓度下(100 μg/ml)均对SGC-7901及A549肿瘤细胞株生长有重度抑制作用，其中TF3G对四种肿瘤细胞(SGC-7901、A549、K562和HepG2)均有抑制作用(50 μg/ml浓度以上)，TF在高浓度下(100 μg/ml)对HepG2有微弱的抑制作用。

目录

文摘

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论文说明:缩写词表

声明

第一章 绪论

1研究目的与意义

2茶黄素的国内外研究动态

2.1茶黄素的组成和结构

2.2茶黄素体外生物合成的研究

2.3茶黄素分离的研究进展

2.4茶黄素药理功能

3研究内容和关键技术

3.1研究内容

3.2关键技术

第二章 多酚氧化酶酶源的优选

1材料与方法

1.1材料、试剂和主要仪器

1.2方法

2结果与分析

2.1不同来源PPO及不同品种梨PPO同工酶组成

2.2不同来源PPO及不同品种梨PPO活性比较

2.3 PPO同工酶组成、活性与茶黄素合成的关系

2.4不同品种梨PPO活性、同工酶组成对茶黄素合成的影响

3讨论

第三章 茶黄素的酶促合成

1材料与方法

1.1材料、试剂和主要仪器

1.2茶黄素酶促合成最佳合成条件的优化

1.3最佳反应条件的优化

1.4最佳反应时间的确定

2结果与分析

2.1不同品种梨多酚氧化酶活性比较

2.2不同反应底物(儿茶素组成)对茶黄素形成的影响

2.3模拟氧化条件的优化试验

2.4最佳反应条件的确定

2.5反应时间对茶黄素形成的影响

3讨论

第四章 高纯茶黄素的制备和茶黄素单体的分离

1高纯茶黄素的制备

1.1材料和方法

1.2结果与分析

2高效薄层色谱分离茶黄素及红茶酚性色素

2.1材料与方法

2.2结果与分析

3制备型高效液相色谱法分离茶黄素单体

3.1材料和方法

3.2结果与分析

4制备型高速逆流色谱法(HSCC)分离茶黄素单体

4.1材料和方法

4.2结果与分析

5讨论

5.1高纯茶黄素的制备

5.2茶黄素单体的分离

5.3红茶酚性色素的分离

第五章 茶黄素单体的结构鉴定

1材料与方法

1.1主要仪器

1.2主要试剂

1.3方法

2结果与分析

2.1单体化合物类别及功能基鉴别

2.2化合物A的鉴定

2.3化合物B的鉴定

2.4化合物C的鉴定

2.5化合物D的鉴定

3讨论

第六章 茶黄素降血脂、抗炎和抗肿瘤活性的高通量筛选

1材料与方法

1.1材料、试剂和主要仪器

1.2方法

2结果与分析

2.1加药量的确定

2.2茶黄素对PPARs、LXR核受体模型效果

2.3茶黄素对FXR核受体模型效果

2.4茶黄素对TNFa和IL-1分泌抑制模型效果

2.5茶黄素对肿瘤模型(SGC-7901、K562、A549、HepG2)效果

3讨论

3.1茶黄素降血脂活性

3.2茶黄素抗肿瘤活性

全文结论

论文创新点

展望

参考文献

附图

致谢

作者简介