根癌农杆菌介导转化鄂抗棉9号愈伤组织获得含Chitinase和β-（1，3）-glucanase基因的棉花再生植株

摘要

该试验利用根癌农杆菌介导的转基因方法,将双价抗真菌基因几丁质酶基因(Chitinase)和β-(1,3)葡聚糖酶基因(Glucanase)导入鄂抗棉9号胚性愈伤组织,结果表明:1.IBA和KT及无机盐对鄂抗棉9号下胚轴再生有重要影响.在1.0mg/l IBA和0.5mg/l KT时为最佳配比,在愈伤组织诱导和增殖期间,培养基中分别添加120mgl<'-1>的硫酸镁和42mgl<'-1>硫酸亚铁,使愈伤向胚分化方向发育.在诱导愈伤时NH<,4>NO<,3>不是可缺少的,否则体细胞难以分化再生,但向胚性愈伤转变时,NH<,4><'+>必须撤去,同时补加1900mgl<'-1>的KNO<,3>,KNO<,3>能促使胚的分化;到胚分化生长成苗时,需附加谷氨酰胺和天门冬酰胺,分别为1000 mgl<'-1>和500 mgl<'-1>,可以增加胚分化率和利于胚生长.2.优化了根癌农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织转化体系.以鄂抗棉9号愈伤组织为外植体,对转化的几个重要参数,如预培养的有无,共培养温度,乙酰丁香酮的有无,卡那霉素的选择浓度进行了筛选.结果表明:预培养5-10天较没有预培养的愈伤表现出更强的转化效率;共培养温度以19℃为适宜温度;使用乙酰丁香酮和不使用乙酰丁香酮效果不明显;卡那霉素的选择浓度以100 mg/l为宜.3.获得了60株抗性小苗,随机选取20株做PCR检测,有14株检测结果为阳性,取6株PCR阳性植株进行Southern检测,结果表明外源基因已经整合到棉花基因组中,拷贝数由1到3个不等.4.对海岛棉的再生进行了初步研究.实验表明:2,4-D 0.15 mg/l/KT 0.5 mg/l时为新海14心形胚的诱导的最佳组合.

目录

摘要

Abstract

缩略词表

前言

1问题的提出

2前人的研究进展

2.1植物遗传转化的研究进展

2.2棉花遗传转化的研究进展

2.3葡聚糖酶和几丁质酶研究进展

3棉花体细胞胚胎发生和植株再生

4本课题研究的目的和意义

材料和方法

1供试材料

1.1植物材料

1.2供试质粒和农杆菌菌株

1.3主要生化试剂：

1.4培养条件及不同培养基配方

2方法

2.1鄂抗棉9号胚性愈伤组织的诱导

2.2鄂抗棉9胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性实验

2.3农杆菌侵染液的制备

2.4遗传转化相关参数的筛选

2.5转化的棉花材料的分子鉴定

2.6海岛棉体细胞胚胎发生的初步研究

结果分析

1鄂抗棉9号再生体系的建立

2根癌农杆菌介导的鄂抗棉-9胚性愈伤组织的转化体系的优化

2.1预培养的有无对转化效率的影响

2.2共培养温度对转化效率的影响

2.3乙酰丁香酮(AS)对转化效率的影响

2.4卡那霉素有效筛选浓度试验

3棉花抗性愈伤组织的选择和转基因植株的获得

4再生植株的分子检测

5再生植株的Southern blotting分析

6再生植株的嫁接移栽

7海岛棉体细胞胚胎发生的初步研究

讨论

1鄂抗棉9号体细胞胚胎发生研究

2影响根癌农杆菌介导转化鄂抗棉9号胚性愈伤组织的因素

3筛选过程中农杆菌污染现象

4卡那霉素对再生的胚性愈伤分化的抑制

5愈伤组织作为转化外植体的优缺点

6继代过程中的幼苗根系受损现象

7几丁质酶和葡聚糖酶在生产上的应用前景

8海岛棉体细胞胚胎发生的初步研究

参考文献

图版说明

图版1棉花体细胞胚胎发生与植株再生

图版2：棉花遗传转化再生过程

图版3：海岛棉下胚轴不同激素组合诱导愈伤

致谢