哈氏弧菌外膜蛋白和脂多糖的研究

摘要

该研究采用免疫学技术、微生物学技术、蛋白质技术等提取哈氏弧菌(Vibrioharveyi)主要保护性抗原外膜蛋白(Outermembraneprotein，OMP)和脂多糖(Lipopolysaccaride，LPS)，并分析了其结构组成、免疫特性，探讨培养及提取条件对OMP表达的影响；同时以大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)为试验对象，初步研究了保护性抗原对大黄鱼免疫机能的影响。 主要结果如下： 1.分别采用Sarkosyl法和改进的酚水法提取V.harveyiOMP和LPS，利用SDS-PAGE、免疫印迹(Western-blot)试验分析其种类组成和免疫反应性。结果表明，3种血清型菌株来源的OMP主要由分子量为31kD-43kD的条带组成，LPS主要条带的分子量分布在20kD-120kD范围内；各菌株间LPS和OMP其SDS-PAGE图谱差异明显，但均存在共同条带。吸附后的兔抗V.harveyi与3菌株来源的OMP的免疫印迹反应存在差异，分别表现出2条和1条免疫反应带；其中64kD反应带为3菌株共有；3菌株LPS的Western-blot结果有较大差异，分别表现了7条、2条和4条免疫反应带，其中31kDLPS为3菌株共有。 2.经不同培养时间提取的LPS，在0h-48h内产量逐渐增加；LPS电泳图谱存在差异，30h时间点表现出更多的蛋白条带及免疫反应带；所有时间点的LPS具有两条共同的印迹带(31kD和52kD)；各个时间点提取的OMP电泳图谱无明显变化，免疫印迹显示主要有一条共同反应带(64kD)。研究结果表明，培养时间对OMP的表达和免疫反应性没有明显影响；而对LPS的产量、表达种类和免疫反应性均有较大的影响，培养30h左右提取的LPS免疫特异性最强。 3.在不同的培养及提取条件下，提取V.harveyi外膜蛋白，经过SDS-PAGE分析发现，在不同培养时间、不同培养方式、不同pH值和无Fe培养基条件下提取的OMP电泳图谱无明显差异，主要条带为74kD、42kD、40kD、37kD、34kD。不同培养温度下提取OMP图谱有差异，差异不大。利用4种方法提取OMP，用蛋白酶抑制剂PMSF提取OMP，图谱条带最多；SDS提取的OMP图谱条带最少且不清晰；而Sarkosyl法与TritonX-100相比，差异并不明显，TritonX-100抽提的OMP高分子量区域条带较多。结果表明，提取OMP的最适宜细菌培养条件和提取方法为：培养基pH值6.5-7.6，振荡培养，培养温度25℃-34℃，培养时间24h-36h，提取方法采用Sarkosyl法。 4.采用代表不同血清型的3株V.harveyi菌株，分别制备LPS、OMP和福尔马林灭活FKC，作为免疫原，注射接种大黄鱼，免疫接种不同时间后，测定受免鱼血清中凝集抗体效价、血清溶菌酶活性和血液白细胞吞噬活性，28d后测定免疫保护力，结果表明，3种抗原对大黄鱼均有较强的免疫原性。免疫组血清凝集抗体效价逐渐增高，28d时最高；溶菌酶活性21d达到峰值，随后逐渐下降；白细胞吞噬活性7d后迅速增高，14d后缓慢升高，21d达峰值，随后下降。受免后7d、14d、21d、28d，各组之间，免疫组大黄鱼各项免疫指标明显高于对照组；FKC能够诱导受免鱼产生最高凝集抗体效价，LPS、OMP组凝集抗体效价低于全菌(FKC)组，而免疫保护率检测结果则表明，LPS、OMP组的免疫保护率却明显地高于FKC组，各组间免疫保护率大小顺序为LPS组＞OMP组＞FKC组＞＞对照组。LPS和OMP免疫组能够获得更好的保护效果，提示了LPS和OMP是V.harveyi的重要保护性抗原。

目录

摘要

英文缩略及细菌英文名列表

第一章鱼类致病菌主要保护性抗原的研究进展

1主要保护性抗原

1.1脂多糖(LPS)

1.2外膜蛋白(OMP)

2主要保护性抗原与菌苗免疫原性之间的关系

3保护性抗原的提取

3.1 LPS的提取方法

3.2 OMP的提取方法

4影响保护性抗原的表达和产量的主要因素

4.1环境条件

4.2培养方式

4.3培养温度

4.4提取方法

4.5培养时间

4.6其他

5存在的问题和发展方向

研究的目的与意义

第二章哈氏弧菌外膜蛋白和脂多糖的提取及特性分析

1材料与方法

1.1材料

1.2免疫血清的制备

1.3 LPS的提取和含量测定

1.4 OMP的提取和含量测定

1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.6免疫印迹实验(Western-blot)

2结果与分析

2.1 SDS-PAGE图谱

2.2 Western-blot印迹

2.3 OMP和LPS产量在细菌不同生长阶段的变化

3讨论

3.1关于OMP和LPS的提取

3.2 OMP组、LPS组与血清型间的关系

3.3 OMP和LPS的抗原特异性

3.4培养时间对免疫特性的影响

4 小结

第三章培养及其提取条件对哈氏弧菌外膜蛋白表达的影响

1材料与方法

1.1菌株及其培养

1.2 OMP的提取

1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2结果与分析

2.1不同时间、pH值和培养方式对OMP表达的影响

2.2不同温度对OMP表达的影响

2.3不同提取方法对OMP特性的影响

3讨论

第四章哈氏弧菌保护性抗原对大黄鱼免疫机能的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2抗原的制备

1.3吞噬原的制备

1.4免疫与采血

1.5凝集抗体效价的测定

1.6溶菌酶活性的测定

1.7白细胞吞噬活性的测定

1.8攻毒菌液的准备

1.9攻毒

1.10数据处理

2结果与分析

2.1保护性抗原对凝集抗体效价的影响

2.2保护性抗原对受免鱼血清溶菌酶活性的影响

2.3保护性抗原对受免鱼血液白细胞吞噬活性的影响

2.4保护性抗原的免疫保护性

3讨论

3.1 3种抗原免疫效果的比较

3.2保护性抗原对大黄鱼免疫机能的影响

参考文献

附录 试剂、缓冲液和染色液的配制

致 谢