植物染色体DNA重要组成因子——端粒和着丝粒序列的研究

摘要

端粒位于真核生物染色体的末端，它是保证染色体的精确复制，维持染色体长度及稳定性的功能性结构。端粒主要是由5-8bp的串联重复序列及相关的蛋白质因子组成的复合体，串联重复序列的一条链富含C，一条链富含G，通过非Waston-Crick的方式形成G—G配对的四链平行的G4四聚体的立体结构，这种独特的G4四聚体结构为端粒在真核细胞中抵抗核酸酶的侵袭、保证真核生物基因组的完整性提供了充足的抵抗力。但是端粒独特的短高度重复序列和G—G特殊配对也决定了，端粒序列在大肠杆菌等原核生物中利用DNA聚合酶而不是真核生物的端粒酶复制时，会产生跳跃复制和G—G发卡结构阻碍复制进行的问题，从而使得包含端粒序列的质粒在大肠杆菌细胞中很难稳定的存在，会发生缺失甚至整个质粒丢失的现象。 着丝粒是真核生物染色体的标志性结构，在有丝分裂和减数分裂中，着丝粒和特异性的蛋白结合成动粒，由微管结合在动粒上牵引染色单体向两极运动。因此，着丝粒作为有丝分裂和减数分裂过程的直接参与者，在细胞周期中有着举足轻重的作用。由于着丝粒主要是由高度重复序列组成，不易构建测序时所用的克隆重叠群，因此尽管着丝粒被发现的很早，却成了人们理解真核生物最后的边界。除了象人类染色体4和8以及细胞中的B染色体等几个比较特化的着丝粒以外，至今还没有一个物种的着丝粒区域被完整、完全地测序。着丝粒还有一个不同寻常的特点，即虽然其功能在所有真核生物中极为保守，但是其序列却极为不保守，是真核生物进化最快的序列之一。这也违反了“保守的功能一般会有相对应的保守的序列”的原则，使得着丝粒区域更成为人类理解真核生物的一个谜。拟南芥的着丝粒卫星序列为180bp长的高度重复序列，拟南芥测序计划的完成，使得十字花科植物很有优势成为研究着丝粒在进化的模式组，帮助人们去洞察这个模式组的进化和歧化关系以及着丝粒的功能角色。由于早期对十字花科的分类，主要是人为的根据形态学和分子标记上进行的，而不是依照各个物种间的进化关系确定的。研究十字花科植物着丝粒卫星序列的进化关系，也有利于人们更好的把握该科植物的进化地位，为其按照进化关系重新正确的划分定位。 本研究通过利用T4 DNA聚合酶将PCR扩增出的拟南芥端粒序列平滑化后连入钝端载体的方法，构建了包含拟南芥端粒序列的大肠杆菌克隆。结合聚丙烯酰氨凝胶电泳的方法，我们对比了质粒双酶切和PCR扩增两种检测方法检测插入端粒序列长度大小的可靠性。通过在30°C条件下对所得端粒克隆连续接种继代培养，发现培养过程中端粒的复制是稳定的。研究结果可能从方法学上，对如何将短重复序列插入到质粒载体中、准确的鉴定插入的重复序列的长度、判断大肠杆菌的培养条件是否基本满足了重复序列复制相对稳定的需要以尽量完好的保存所获得的高度重复序列克隆具有一定的意义。 本实验室还通过利用Hind III酶切油菜基因组DNA后，回收特异性的180bp着丝粒卫星序列连接到载体中的方法获得了包含甘蓝型油菜着丝粒卫星序列的克隆。白菜基因组（AA）中有两种类型的着丝粒卫星家族序列，我们也有理由推论，甘蓝型油菜（AACC）和芥菜型油菜（AABB）中至少也存在两种以上的着丝粒卫星家族序列。进一步分离和分析这些不同亚种的着丝粒卫星家族，可以使我们更加深入的理解它们的进化关系，或许还可以帮助我们更加有效、更加方便的选育油菜优良品种。 真核生物的染色体三大关键成份便是端粒、着丝粒、自主复制序列。拥有了这三个必需的成份，人们便有可能尝试着构建新型的转化载体──人工染色体。人工染色体可以一次性的将很多控制优良性状的基因方便的带入到真核细胞中，而且没有T-DNA转化时随机插入容易引起的细胞中原功能基因失活的现象，因此是一种非常优良的载体。目前哺乳动物和人类的人工染色体己经构建成功，美国芝加哥大学Preuss和中国科学院遗传与发育研究所的程祝宽研究员等领导的课题组也分别正在构建拟南芥和水稻的植物人工染色体。 我们实验室已经分离到了油菜的着丝粒序列、油彩的端粒序列（即本文中分离到的植物界绝大部分植物通常具有的拟南芥TTTAGGG序列类型，油菜的端粒序列也属于该类型），希望能够利用已经获得的甘蓝型油菜着丝粒卫星序列作为探针筛选已经构建好的甘蓝性型油菜的BAC库，将筛选到的包含大片段的着丝粒序列的BAC克隆和已经构建好的植物端粒序列以及植物自主复制因子序列通过酶切连接的方法连在一起，构建出油菜的植物人工染色体。

目录

文摘

英文文摘

第一部分前言

第二部分材料与方法

第三部分结果与分析

第四部分讨论

参考文献

致谢