川桑着丝粒与端粒重复序列及染色体定位

摘要

重复序列是构成高等植物基因组的重要组成部分，不仅在维持染色体的空间结构、基因的表达调控、遗传重组等方面都具有重要作用，而且串联重复的DNA簇往往具有种属甚至染色体的特异性。因此，克隆和分析重复序列是研究高等植物基因组的有效手段。川桑（Morus notabilis）基因组大小约为330Mb，含有128Mb的重复序列。本文首次对川桑着丝粒串联重复序列（Centromeric tandem repeat sequence，CTR）和端粒相关序列（Telomere associated sequence，TAS）进行了研究，并采用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）将它们应用于川桑的核型分析中，获得的主要研究结果如下：
　　1．采用生物信息学方法，对川桑基因组重复序列进行了由高到低的复杂度排序，筛选出拷贝数最多、排布区域最大的4条DNA序列的重复单元作为川桑候选着丝粒串联重复序列，分别命名为CCTR964、CCTR723、CCTR327、CCTR251。这4条序列与其他物种的着丝粒串联重复序列的相似性较低，介于1％至28%之间，具有较高的物种特异性。随后将其制备为探针，分别与川桑中期染色体进行荧光原位杂交，研究发现：
　　①CCTR964在川桑1号、2号、4号、6号染色体的着丝粒及3号染色体的近着丝粒短臂上有杂交信号；
　　②CCTR723定位于川桑2号染色体近着丝粒短臂和5号染色体的着丝粒上；
　　③CCTR327在川桑3号、4号、5号染色体的着丝粒处有所分布，其中在3号、4号染色体的着丝粒处信号较弱，在5号染色体的着丝粒处信号强烈，此外，还在1号、2号染色体两臂的近着丝粒处成散在分布；
　　④CCTR251在除6号染色体以外的其他染色体的着丝粒处都有分布，其中，在2号、3号染色体的着丝粒处的分布最为明显。因此，初步断定这4条序列均为川桑着丝粒串联重复序列。
　　2．分别以拟南芥端粒简单重复序列（Telomere repeat sequence，TR）(TTTAGGG)4、(CCCTAAA)3为单引物，在川桑基因组中进行扩增，在前者扩增产物中获得1条长度为540bp的DNA序列，在后者扩增产物中获得1条403bp的DNA序列和1条420bp的DNA序列。将其依次命名为TAS1、TAS2、TAS3。经序列分析发现，这3条序列均富含AT，符合卫星序列的特点。此外，这些序列中除含有不同数目的拟南芥型端粒简单重复序列单元的突变体外，还存在着其他类型的重复单元，如家蚕TR单元CCTAA、番茄TR单元TTTGGG。同源性分析发现，TAS1、TAS2、TAS3与其他物种的端粒相关序列相似性均很低，同样呈现较高的物种特异性。
　　荧光原位杂交研究结果显示：
　　①TAS1在川桑2号染色体短臂末端，4号、5号染色体两端，6号染色体一端有明显分布，在其他染色体上几乎没有信号；
　　②TAS2在川桑1号、6号染色体两端，2号染色体短臂、3号长臂、4号和5号染色体的一端有所分布，只在7号染色体上没有检测到信号；
　　③在较高洗脱严谨度的条件下，TAS3在川桑7对同源染色体上均有所分布，但未涵盖所有染色体的末端，并且信号的强度均较弱。当提高洗脱强度时，无法检测到TAS3序列的定位信号，因此，推测TAS3在川桑染色体上具有较低的拷贝数。
　　3．结合CCTR964、CCTR723、CCTR251及TAS1、TAS2探针在各条染色体上的杂交信号，建立了川桑标准染色体的核型模式图，给川桑的核型分析提供了新的依据，为川桑染色体的精确识别提供了借鉴和参考。

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第一章 文献综述

1.1 高等植物重复序列概述

1.2 高等植物的着丝粒

1.3 高等植物的端粒

1.4 桑树重复序列研究进展

第二章 引 言

2.1 研究目的和意义

2.2 主要研究内容

2.3 技术路线

第三章 川桑着丝粒重复序列获取及染色体定位

3.1 材料和试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 川桑端粒相关序列获取及染色体定位

4.1 材料和试剂

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论与小结

第五章 综合与展望

5.1 川桑着丝粒与端粒重复序列的获取及FISH验证

5.2 川桑标准染色体核型模式图的建立

5.3 展望

缩略词表

参考文献

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢