大豆皂甙的结构鉴定及其生物活性研究

摘要

大豆皂甙广泛存在于豆科植物中，大豆是皂甙的主要膳食来源。对于大豆皂甙的结构与分类以及生物活性研究已有不少文献报道，有关大豆皂甙降血脂、抗癌、调节免疫、抗氧化、抗诱变和抑制HIV病毒等方面的研究工作更是成为学术界研究的热点。但是关于大豆皂甙抗肿瘤、降血脂的作用机制研究却鲜见报道。本文以天门大豆为原料，利用HPLC-ESI／MS<'2>对分离纯化得到的大豆皂甙进行结构鉴定，并采用生物学前沿技术激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪、RT-PCR等对大豆皂甙的生物活性，包括抗氧化、体内外抗肿瘤、降血脂的功能作用与机制进行了系统的探索。 主要研究结果如下： 1.大豆皂甙的分离纯化与结构鉴定 脱脂大豆粉用80％乙醇溶液按1:27(W／V)的料液比在60℃下浸提5h，连续提取三次后达到最佳效果，大豆皂甙的提取率为2.58％。大豆皂甙醇提液经浓缩、正丁醇萃取、乙酸乙酯沉淀和大孔树脂D101A柱层析等方法纯化得到了SS-Ⅰ、SS-Ⅱ和SS-Ⅲ三个组分，得率分别为0.107％、0.093％和0.047％。采用HPLC-ESI／MS<'2>联用技术对这三个组分进行系统分析与鉴定，发现SS-Ⅲ中含有Ba、Bb、Bc、Bb’和Be五种皂甙，SS-Ⅱ中除了含有SS-Ⅲ中五种皂甙外还含有A2，与SS-Ⅲ比较，SS-Ⅰ中还富含Al、A4和A2三种皂甙。 2.大豆皂甙体外抗脂质过氧化研究 大豆皂甙在体外具有很强的抗脂质过氧化活性。在大鼠肝匀浆和肝线粒体中加入不同浓度的SS-Ⅰ和SS-Ⅱ，分别研究了它们对大鼠肝组织自发性、H<,2>O<,2>-Fe<'2+>诱导肝组织损伤和肝线粒体生成MDA的影响。结果表明SS-Ⅰ和SS-Ⅱ均能抑制大鼠肝组织和肝线粒体脂质过氧化物的生成，对H<,2>O<,2>-Fe<'2+>诱导的肝组织过氧化损伤具有保护功效。在同样的浓度范围内，SS-Ⅰ抑制脂质过氧化作用的能力强于SS-Ⅱ，这可能与其组成及分子结构有关。 3.大豆皂甙对人宫颈癌HeIa细胞凋亡的研究 首次提出大豆皂甙诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡是其抗肿瘤活性的主要机制，细胞周期改变、线粒体跨膜电位下降、细胞胞浆内Ca<'2+>浓度升高以及NO含量增加可能是细胞凋亡的作用机理之一。MTT实验发现100-400m/L的SS-Ⅱ对Hela细胞的生长有显著的抑制作用，且具有时间-效应和剂量-效应关系，并且对小鼠成纤维细胞L929生长的影响较小。采用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜和激光扫描共聚焦显微镜观察到SS-II作用4d后的Hela细胞呈典型的凋亡形态学改变。TUNEL实验也证实SS-II能诱导Hela细胞凋亡。与对照组比较，流式细胞仪检测到SS-II作用的Hela细胞细胞周期发生改变，并且细胞线粒体跨膜电位降低，激光扫描共聚焦显微镜检测凋亡细胞胞内Ca<'2+>浓度极显著升高，同时细胞中NO含量、NOS和iNOS活性显著增加。 4.大豆皂甙对H<,22>荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究 以H<,22>荷瘤小鼠为模型，灌胃10mg/kg.d、20mg/kg.d和30mg/kg.d的SS-II 20d后均可显著抑制H<,22>移植瘤的生长：30mg/kg.d的SS-II能显著提高H<,22>荷瘤小鼠的迟发型超敏反应强度，三个剂量组的SS-II均能显著促进T淋巴细胞增殖和NK细胞活性。摄入适量的SS-II能降低H<,22>荷瘤小鼠肝脏中MDA含量，并增强SOD活性。与环磷酰胺阳性对照组相比，SS-II不妨碍小鼠正常生长，对机体没有毒副作用。研究表明，SS-II增强H<,22>荷瘤小鼠细胞免疫功能和提高机体抗氧化能力是其抗肿瘤的重要作用机制之一。 5.大豆皂甙预防高脂血症的作用及其分子机制研究 大豆皂甙通过调节肝脏LPL(脂蛋白酯酶)转录水平和提高抗氧化能力抑制脂质过氧化物来预防高脂血症，这一结论未见报道。与高脂模型组比较，高脂饮食同时摄入大豆皂甙(10mg/kg.d、20mg/kg.d、30mg/kg.d)6星期后，这三个剂量组小鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量均分别降低达30％、50％和30％以上，HDL-C含量均升高28％以上。适量的大豆皂甙能显著降低进食高脂饲料小鼠肝脏中TC、TG和MDA的含量，增强SOD和LPL活性。逆转录聚合酶链反应实验发现高脂组小鼠LPL mRNA表达水平较正常组下降，而大豆皂甙能促进高血脂小鼠LPLmRNA的表达。

目录

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摘要

缩略语表

前言

第一章大豆皂甙的分离纯化与结构鉴定

第二章大豆皂甙抗脂质过氧化作用研究

第三章大豆皂甙对人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究

第四章大豆皂甙对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究

第五章大豆皂甙预防小鼠高脂血症的作用及其分子机制研究

第六章结论

第七章综述：恶性肿瘤的细胞凋亡疗法

参考文献

致谢

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