交沙霉素生产菌株的菌种选育研究

摘要

通过对本实验室保藏的交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)JM6、JM8、JM14、JM30和JM310菌株进行活化、摇瓶发酵和传代稳定性试验，确定遗传性能较为稳定的JM8(9.3μg/mL)为诱变育种的出发菌株。 对JM8菌株进行氯化锂-紫外线诱变育种，结合链霉素抗性平板筛选，获得比出发菌株JM8效价分别提高9.32倍和6.34倍的菌株UV90(96.0μg/mL)和UV50(68.3μg/mL)，对UV90进行60Co-γ射线辐射诱变，所得诱变菌株效价不高且易发生回复突变，未能筛选到高产菌株。对氯化锂-紫外线诱变获得的另一高产菌株UV50(68.3μg/mL)进行分离复壮，获得一株效价较高、遗传性能较为稳定的菌株UV50-20(70.7μg/mL)。以UV50-20为出发菌株，探索菌龄和溶菌酶浓度、酶解时间及酶解温度对原生质体形成和再生的影响，确定制备原生质体的适宜条件为：选用种子液中培养34小时的菌丝体，在4mg/mL的溶菌酶浓度下，于32℃水浴中酶解90min。对菌株UV50-20进行了原生质体再生筛选，获得了遗传性能较为稳定的菌株Y19(0μg/mL)和效价比UV50-20提高1.22倍的菌株Y13(157.3μg/mL)；对Y13进行原生质体-紫外线诱变，得到比Y13效价提高15.89％的菌株YU15(182.3μg/mL)。通过紫外灭活YU15原生质体，并与Y19原生质体融合筛选得到一株比亲本菌株效价提高17.72％的融合子R29菌株(214.6μg/mL)。传代试验表明菌株JM8、UV50、UV50-20、Y19、Y13、YU15和R29传代均比较稳定。 利用SAS软件以菌株R29为试验菌株进行了发酵培养基配方的优化研究。首先，采用Plackett-Burman设计法法筛选出影响R29发酵合成交沙霉素的主要因素为棉籽饼粉和豆油，继而利用最陡爬坡路径试验找到试验中心点，综合中心组合设计和响应面分析法确定主要因素的最佳浓度。试验发现采用1.9％棉籽饼粉和0.41％豆油，交沙霉素生物发酵效价达到最大值550μg/mL，比优化前的原始配方提高10.66％。 另外，对菌株JM8和菌株R29发酵过程中的菌丝湿重、滤速、糖含量、铵离子含量及效价进行了测定，为交沙霉素工业发酵提供参考指标。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

1 前言

1.1交沙霉素的产生菌

1.2交沙霉素的基本性质

1.2.1交沙霉素的理化性质

1.2.2交沙霉素的抗菌活性和特点

1.3交沙霉素的合成和化学改造

1.3.1交沙霉素的全合成

1.3.2交沙霉素的生物合成

1.3.3交沙霉素的化学改造

1.4交沙霉素的作用机理和临床应用

1.4.1交沙霉素的作用机理

1.4.2交沙霉素的临床应用

1.5交沙霉素的定量检测方法

1.5.1微生物检定法

1.5.2高效液相色谱法

1.5.3分光光度法

1.6交沙霉素的产销现状

1.7抗生素产生菌育种的研究

1.7.1常规诱变育种

1.7.2原生质体技术育种

1.8本试验研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

2.1.2培养基

2.1.3 试剂

2.1.4试验仪器

2.2试验方法

2.2.1培养条件

2.2.2分析方法

2.2.3诱变处理方法

2.3高产菌株的选育

2.3.1 出发菌株的选择

2.3.2紫外线-氯化锂复合诱变

2.3.3 60Co-γ射线辐射诱变

2.3.4原生质体再生菌株筛选

2.3.5原生质体-紫外复合诱变

2.3.6原生质体融合

2.4发酵培养基的优化

2.4.1 Placket-Burman设计

2.4.2最陡爬坡试验

2.4.3 中心组合设计和响应面分析

2.4.4验证性试验

2.5菌株发酵参数的测定

3结果与分析

3.1 交沙霉素生物测定方法研究的结果

3.1.1标准曲线的绘制

3.1.2发酵液浸提溶剂的选择

3.1.3初筛营养菌块的贴放方法的确定

3.2 出发菌株的选择

3.3预萌发孢子悬液的氯化锂-紫外诱变

3.3.1紫外线照射不同时间的诱变效果比较

3.3.2硫酸链霉素最小抑制浓度的确定

3.3.3紫外诱变菌株的筛选

3.4 60Co-γ射线对菌株UV90的诱变

3.4.1不同辐照剂量下的诱变效果比较

3.4.2 60Co-γ射线诱变菌株复筛

3.5原生质体技术

3.5.1 出发菌株的复壮

3.5.2原生质体的制备和再生

3.5.3原生质体再生菌株的筛选

3.5.4原生质体紫外诱变菌株的筛选

3.5.5原生质体融合筛选

3.6传代稳定性试验

3.7发酵培养基的优化

3.7.1 Pluekett-Burman试验设计结果

3.7.2最陡爬坡试验结果

3.7.3 中心组合设计及响应面试验设计结果

3.7.4验证性试验结果

3.8菌株JM8和R29发酵代谢曲线的测定

3.8.1葡萄糖溶液吸光度标准曲线的制定

3.8.2 NH4+吸光度标准曲线的制定

3.8.3发酵过程中代谢曲线测定结果

4讨论

4.1快速筛选方法的建立

4.2传统诱变方法和原生质体技术诱变方法的比较

4.3原生质体技术育种的研究

4.4发酵条件优化的研究

参考文献

致 谢