深海细菌Kocuria sp.Mn22木糖苷酶和木聚糖酶基因的克隆、表达与酶学分析

摘要

木聚糖酶广泛应用于各个工业领域,如作为饲料工业的添加剂能提高饲料的营养价值;在酿酒过程中添加木聚糖酶能提高麦芽汁的过滤效率和酒的清澈度;木聚糖酶水解木聚糖生成的木寡糖是新的具有保健作用的生理活性物质;在造纸工业中,木聚糖酶作为生物漂白剂使用,减少有毒的氯化物对环境的污染,等等。生活在极端环境下的海洋微生物是开发优良特性的木聚糖酶的天然资源。
　　本文从厦门海洋三所提供的海洋细菌中筛选得到一株高产木聚糖酶的深海细菌考克氏菌(Kocuria sp.Mn22),通过鸟枪法构建文库,首次克隆了该菌的木糖苷酶(β-xylosidase)基因和内切木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase)基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并研究其酶学性质。
　　主要研究结果如下:
　　1.以pUC18为载体构建基因组文库,通过木聚糖平板刚果红染色筛选得到含木聚糖酶基因的阳性克隆pUC-kxyn。测序分析表明插入片段包含了四个开放阅读框:分别为ABC类转运系统的通透酶组分、β-木糖苷酶(Kxyn3)、β-1,4-木聚糖酶(Kxyn10)和木糖阻遏蛋白(xylose repressor)。其中β-木糖苷酶(Kxyn3)和β-1,4-木聚糖酶(Kxyn10)结构完整,通透酶和木糖阻遏蛋白结构不完整。
　　2.kryn3基因全长2358 bp,GC含量高达74％,编码786个氨基酸,分子量为82,358 Da。通过BLAST比对,Kxyn3属于第3家族糖苷水解酶,与Streptomycesthermoviolaceus的木糖苷酶氨基酸同源性最高(56％)。将kxyn3基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,纯化木糖苷酶并分析其酶学性质。该酶在55℃和pH6.5时酶活最高;Hg2+和Cu2+强烈抑制木糖苷酶活性,Mn2+轻微抑制酶活,而K+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Na+以及EDTA几乎不影响酶活,DTT对酶活有10％的促进作用。以对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(PNPX)为底物,Kxyn3的Km为1.04 mmol/L,Vmax和kcat分别为150μmol/min·mg和41.2/s。Kxyn3同时具有木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性。
　　3.kxyn10基因全长为1170bp,GC含量为70％,编码390个氨基酸,其中前30个氨基酸残基为信号肽,去掉信号肽后,分子量为40,825 Da,通过BLAST比对Kxyn10属于第10家族糖苷水解酶,与Thermobifida fusca YX的木聚糖酶氨基酸同源性最高(63％)。
　　设计引物,将kxyn10克隆到表达载体pGEX-6p-1上,纯化木聚糖酶并分析酶学性质,发现Kxyn10在55℃和pH8.5时酶活最高,为碱性木聚糖酶。同时Kxyn10具有很强的耐碱性,pH7-12环境下仍有80％以上的活性。另外Kxyn10热稳定性较好,55℃处理1 h后仍有70％的酶活。Mg2+、Na+、K+、Ca2+、β-巯基乙醇和DTT不影响Kxyn10的活性,但是Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+和EDTA强烈抑制其活性。Kxyn10对SDS具有一定的耐受性,5 mmol/L SDS处理后仍有90％的活性。该木聚糖酶对桦木木聚糖的Km值为5.4 mg/mL,Vmax为272μmol/min.mg,kcat为185.1/s。
　　该酶水解木聚糖的产物为木二糖和木三糖,能水解的最短链的寡糖是木四糖。底物特异性实验证明该木聚糖酶没有纤维素酶活性,特异性水解木聚糖。通过酶学性质的研究,表明Kxyn10在多个工业领域,尤其是造纸工业,具有潜在的应用价值。

目录

摘要

Abstract

缩略语表

1.前言

1.1 木聚糖

1.2 木聚糖酶

1.2.1 木聚糖酶系

1.2.2 木聚糖酶的多样性

1.2.3 木聚糖酶的生化特性

1.2.4 木聚糖酶的分类

1.2.5 木聚糖酶的分子结构

1.2.6 木聚糖酶的作用机理

1.2.7 木聚糖酶基因的克隆与表达

1.2.8 木聚糖酶的应用

1.3 木糖苷酶

1.4 本论文研究目的及意义

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 溶液

2.1.5 仪器设备

2.2 高产木聚糖酶海洋细菌的筛选

2.2.1 玉米芯木聚糖的制备

2.2.2 透明圈法筛选木聚糖酶产生菌

2.3 质粒DNA的制备

2.4 海洋细菌基因组DNA抽提

2.5 海洋细菌基因组文库的构建

2.5.1 载体酶解、脱磷

2.5.2 海洋细菌基因组DNA部分酶解

2.5.3 酶连

2.5.4 转化

2.6 木聚糖酶活性克隆的筛选

2.7 生物信息学分析插入片段

2.8 海洋细菌木糖苷酶(xylosidase)Kxyn3研究

2.8.1 木糖苷酶基因kxyn3克隆

2.8.2 木糖苷酶的表达与纯化

2.8.3 木糖苷酶酶学性质研究

2.9 木聚糖酶(β-1,4-xylanase)Kxyn10研究

2.9.1 木聚糖酶基因kxyn10的克隆

2.9.2 木聚糖酶的表达与纯化

2.9.3 木聚糖酶的酶学性质

3.结果与分析

3.1 高产木聚糖酶海洋细菌的筛选

3.2 Kocuria sp.Mn22基因组文库的构建

3.2.1 载体制备

3.2.2 Kocuria sp.Mn22基因组部分酶解

3.2.3 文库的验证

3.2.4 文库的筛选

3.2.5 生物信息学分析插入片段

3.3 木糖苷酶(Kxyn3)的研究

3.3.1 木糖苷酶基因(kxyn3)克隆

3.3.2 Kxyn3表达与纯化

3.3.3 Kxyn3酶学性质研究

3.4 木聚糖酶Kxyn10相关研究

3.4.1 木聚糖酶基因kxyn10克隆

3.4.2 木聚糖酶Kxyn10表达与纯化

3.4.3 木聚糖酶Kxyn10酶学性质研究

4.讨论

4.1 木糖苷酶Kxyn3相关研究

4.2 木聚糖酶Kxyn10的研究

参考文献

致谢

附录

1.木糖苷酶核苷酸及氨基酸序列

2.木聚糖酶核苷酸序列及氨基酸序列

3.公开发表和拟发表的论文及专利