猪霍乱沙门氏菌Ccrp/asd双基因缺失疫苗中间试验

摘要

猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis）是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，也曾是危害我国养猪业的主要疾病之一。虽然目前在我国规模化猪场已不是严重的传染病，但在农村散养户还普遍存在，造成一定的经济损失。同时，沙门氏菌污染的动物产品可使人发生食物中毒，因而具有公共卫生学意义。目前控制猪霍乱的疫苗为猪霍乱沙门氏菌C500弱毒疫苗，该疫苗是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株，虽具有较好的免疫原性，但具有一定的残余毒力，而且遗传背景不清，在理论上也存在毒力返强的风险。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学和兽医学的广泛重视，它主要优点是沙门氏菌可以经粘膜途径免疫（口服或鼻内），操作方便，对接种对象刺激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，作为基因工程疫苗载体时，能同时激发抗沙门氏菌和外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前研究的沙门氏菌载体多为鼠伤寒，对猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。基于以上原因，本研究室前期开展了相关研究，以猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500为出发菌株，构建了crp（cAMP receptor protein）基因缺失基因工程菌，并证明其毒力降低，在此基础上，进一步缺失了编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶（aspartate beta-semialdehyde）基因asd，构建了asd平衡致死系统，用于高效表达外源基因。研究证实，所构建的系统能成功表达外源基因，并能有效诱导免疫反应，为研制以猪霍乱沙门氏菌为活载体的新型多价疫苗奠定了基础。
　　 本研究在前期工作基础上，按照农业转基因生物安全管理办法要求，扩大动物实验规模，旨在更大范围内观察和测定猪霍乱沙门氏菌C500crp'/asd'作为猪用疫苗的安全性、免疫原性及对周围环境的影响。
　　 选择90头40日龄、90头60日龄和10头妊娠母猪作为试验猪，并将每个不同日龄猪群分别分成三组，组1接种猪霍乱沙门氏菌基因缺失株C500crp'/asd'/，每头份剂量2ml或含菌量为4×109CPF，组2接种C500亲本株，每头份剂量2ml或含菌量为4×109CPF，组3为空白对照组，接种安慰剂生理盐水，剂量为2ml。接种后观测记录体温变化、采食量变化和精神状况，同时于接种后第1d、3d、6d、9d、12d、15d进行粪便采集用于排菌检测，于接种后15d和130d采血用于抗体检测。每组安排5头未接种的对照猪同居混养，观察接种猪对同居混养猪的影响，从而测定接种对环境的影响。
　　 抗体检测表明，接种后第15d，C500亲本株与基因缺失疫苗株的IgG抗体效价均上升，与空白对照组相比具有显著差异，证实了猪霍乱沙门氏菌C500 crp'/asd'基因缺失菌株保持了与C500亲本株相当的免疫原性。在试验过程中实验动物在临床上没有不良反应，试验组体温在接种前后无明显变化，体温波动小于0.5℃，与C500亲本株及空白对照组的体温变化没有差异。达90kg体重的平均日龄分别为：重组菌试验组153d，C500菌试验组154d，空白对照组152d。妊娠母猪的平均窝产仔数分别为：重组菌试验组12头，C500菌试验组11.9头，空白对照组12头，三者差异不显著。同时通过粪便排菌测定也没有发现疫苗株被外排至环境中，对同居混养猪的抗体测定也显示没有感染疫苗株。综上所述，猪霍乱沙门氏菌C500 crp'/asd'基因缺失菌株作为疫苗菌株的临床使用是安全有效的，对周围环境无不良影响。这对该疫苗的进一步应用及研究以猪霍乱沙门氏菌C500 crp'/asd'基因缺失菌株作为载体的多联疫苗奠定了重要基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表(Abbreviation)

声明

1文献综述

1.1猪沙门氏菌病的危害

1.2猪沙门氏菌的病原学特征

1.2.1流行病学

1.2.2发病机制

1.2.3临床症状

1.2.4病理变化

1.2.5诊断

1.3猪霍乱沙门氏菌疫苗及载体的研究进展

1.3.1猪霍乱沙门氏菌疫苗

1.3.2弱毒沙门氏菌载体的优点

1.3.3沙门氏菌载体的应用

2研究目的和意义

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1菌株和质粒

3.1.2药品与试剂

3.1.3主要培养基及其配制

3.1.4主要试剂与缓冲液的配制

3.1.5主要实验器材

3.1.6本实验所用PCR引物

3.1.7实验动物

3.2实验方法

3.2.1质粒的制备

3.2.2沙门氏菌电转化

3.2.3细菌计数

3.2.4双缺失疫苗对猪的免疫

3.2.5免疫后指标观察与检测计划

3.2.6血样采集

3.2.7 ELISA方法测定抗体滴度

3.2.8排菌情况检测

3.3统计学分析

4结果与分析

4.1疫苗准备与鉴定

4.1.1疫苗株C500crp-/asd-/pYA3493的制备

4.1.2制备好的疫苗活菌鉴定结果

4.1.3 PCR鉴定

4.2免疫接种后猪的临床观察

4.3疫苗菌株的环境释放

4.4疫苗菌株的存活能力检测

5讨论与结论

5.1 crp缺失对毒力及效果的影响

5.2 crp缺失对环境的安全性

5.3结论

参考文献

致谢