猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆及其复制子载体的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。我国于1996年首次从国内猪群中分离到PRRSV，从而证实了本病在我国的存在与流行。自2006年6月份以来，在我国南方的湖北、湖南、江西、安徽等省份相继暴发高致病性猪蓝耳病，至少200多万头猪发病，40多万头猪死亡，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失，引起了社会的广泛关注。而正链RNA病毒的反向遗传操作系统在病毒复制、致病机制研究，抗病毒药物筛选和新型疫苗、导向载体制备等方面是一个极其有用的工具。基于此，本研究开展了PRRSV Clone20株的全基因组克隆与测序、遗传进化分析、感染性克隆及其复制子载体的研究。主要研究内容和结果如下：
　　 1．猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Clone20株全基因组克隆、序列测定及遗传进化分析
　　 以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Clone20株为材料，参考GeneBank PRRSV VR2332株（AY150564）全基因序列，我们分四段设计引物，通过RT-PCR扩增了PRRSV Clone20株全基因组，将所得的cDNA克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明：覆盖全基因组cDNA重叠片段A、B、C和D大小依次为3920bp、5715bp、3783bp和3323bp，测序结果经分析正确后，利用DNASTAR软件将4个片段拼接成完整基因组序列，获得全基因组核苷酸序列为15412bp（不含poly（A）尾）；该序列已经递交给GenBank，序列登录号为：FJ899592。
　　 遗传进化树分析表明，我国流行的毒株可以分为2个亚群：以CH-1a为代表的包括JXA1，HUN4等高致病性变异毒株在内的属于亚群1；以VR2332为代表的包含少量国内分离毒株属于亚群2。而本研究的Clone20株属于美洲型，在系统发生树上Clone20与CC-1、MLV和BJ-4株位于同一小分支，与美洲型参考株（VR-2332株）同属于亚群2。
　　 同时利用ClustalX2软件对25株PRRSV全序列同源性分析后，进一步用Simplot软件对可能产生重组的序列进行相似性分析和BOOTSCAN分析；结果显示，我国的PRRSV HB-1株为CH-1a与JX143的重组病毒株，确定了重组区域为12665-14105，证实了重组在PRRSV进化过程起着非常重要的作用。
　　 2．猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Clone20株感染性克隆的构建
　　 本研究使用高保真DNA聚合酶进行基因扩增，每个片段的阳性克隆送3个进行测序，并将测序结果同GenBank中收录的序列进行比较，尽可能地减少PCR引入的突变，获得了较为可靠的基因组cDNA序列。将4个基因片段A、B、C、D依次克隆到低拷贝质粒pOK-12中，同时在全基因组5’端引入CMV启动子序列，在3’端poly（A）后分别引入核酶HDV序列和BGH终止序列，最终获得该毒株的全长cDNA克隆pOK-Clone20。将质粒pOK-Clone20用质脂体转染BHK-21细胞，转染后24小时上清接种Marc-145细胞，连续培养3代，传至第三代出现明显的细胞病变，经RT-PCR扩增sgmRNA7，大小和测序同预期相符，证实获得了有感染性的恢复病毒，表明成功的构建出了具有感染性的PRRSV全长cDNA克隆。为以后在cDNA水平上研究PRRSV的病毒复制、致病机制研究，抗病毒药物筛选和新型疫苗、导向载体制备等方面提供技术平台。
　　 3．猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制子载体的研究
　　 为构建含有报告基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒亚基因组复制子系统，我们首先在构建感染性克隆策略的基础上，利用PCR方法对C片段和D片段上的含ORF2-ORF6的基因进行缺失，在结构基因中保留与猪繁殖与呼吸综合征病毒复制想关的N蛋白序列、上游含TRS7的序列及下游的3’端非编码顺式激活序列，同时利用PCR的方法引入报告基因EGFP，另外，像构建感染性克隆一样，在复制子5’端引入CMV启动子序列，在3’端poly（A）后分别引入核酶HDV序列和BGH终止序列，然后按感染性克隆构建策略依次把各个片段克隆到低拷贝质粒pOK-12中，最终获得含报告基因EGFP的复制子系统质粒pOK-Clone20-rep。将质粒pOK-Clone20-rep用质脂体转染BHK-21细胞，通过观察EGFP荧光、流式分析和RT-PCR，稳定性试验等方法对复制子进行鉴定。结果显示，pOK-Clone20-rep在在BHK-21细胞中均可稳定表达EGFP，可以在BHK-21细胞中检测到N sgmRNA和EGFP sgmRNA，流式分析显示在pOK-Clone20-rep转染的BHK-21细胞中有9.64％的细胞发出荧光，结果表明，PRRSV复制子在BHK-21细胞中能够正常表达和自我复制。本研究所购建的含有报告基因的PRRSV亚基因组复制子系统在BHK-21细胞中均获得了稳定表达，复制子的成功构建为其进一步发展成疫苗载体、为研究病毒复制、致病机制研究及抗病毒药物筛选奠定了基础。
　　 为了进一步探讨PRRSV复制子作为疫苗载体的可能性，以小鼠为模型动物，将复制子载体pOK-Clone20-rep以不同剂量（100μg和10μg）免疫小鼠，试验结果表明，无论体液免疫还是细胞免疫，复制子载体都能较高的体液免疫水平和细胞免疫水平，具有较好的免疫效果。同时复制子也能够激发对N蛋白的体液免疫，表明PRRSV复制子载体可以作为新型的多基因表达的候选疫苗载体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章文献综述

1.1猪繁殖与呼吸综合征

1.2 PRRS的危害及流行病学

1.3 PRRSV病原特性

1.3.1 PRRSV的分类

1.3.2 PRRSV的理化学特性

1.3.3 PRRSV的抗原性

1.3.4 PRRSV的细胞培养特性

1.3.5 PRRSV的致病机理及生物学特性

1.4 PRRSV分子生物学研究进展

1.4.1PRRSV基因组的结构与功能

1.4.2 PRRSV的蛋白质

1.4.3 PRRSV的基因组变异和RNA重组

1.4.4 PRRSV的抗原性变异

1.4.5 PRRSV的毒力变异

1.4.6 PRRSV的准种

1.5正链RNA病毒的感染性克隆的概述

1.5.1病毒反向遗传操作技术体系的提出

1.5.2正链RNA病毒的感染性克隆的操作

1.5.3 PRRSV感染性克隆的历史和发展

1.6病毒复制子载体的概述

1.6.1复制子载体系统的构建原理与方法

1.6.2病毒复制子疫苗的特点

1.6.3病毒复制子DNA疫苗的初步应用

第2章 PRRSV Clone20株全基因组序列的测定及序列分析

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1毒株、细胞、菌株及质粒

2.2.2酶及主要试剂

2.2.3培养基与抗生素及其配制

2.2.4缓冲液

2.2.5病毒的大量增殖、浓缩和纯化

2.2.6病毒RNA的提取

2.2.7全基因组的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

2.2.8全基因组cDNA的克隆

2.2.9 PRRSV全基因组毒株序列测定与分析

2.3结果与分析

2.3.1病毒纯化

2.3.2病毒基因组亚克隆片段的RT-PCR扩增结果

2.3.3亚克隆质粒的构建与鉴定

2.3.4亚克隆质粒序列测定和病毒基因组全序列拼接

2.3.5 PRRSV Clone20株全基因组序同源性和进化树列分析

2.3.6 PRRSV在进化过程中的重组分析

2.4讨论

2.4.1我国的流行PRRSV美洲型亚群分类

2.4.2 RT-PCR对序列的影响

2.4.3同源重组在PRRSV进化过程中的作用

2.5结论

第3章 PRRSV Clone20株全基因组感染性cDNA克隆的构建

3.1研究目的与意义

3.2材料与方法

3.2.1细胞、菌株与质粒

3.2.2酶及主要试剂

3.2.3培养基与抗生素

3.2.4缓冲液

3.2.5全基因组cDNA的连接

2.2.6全长质粒pOK-Clone20质粒转染(脂质体介导转染法)

2.2.7 RT-PCR法检测恢复病毒

3.3结果

3.3.1 PRRSV基因组全长cDNA的构建

3.3.2 PRRSV感染性病毒的拯救

3.4讨论

3.4.1克隆基因序列的准确性

3.4.2感染性克隆质粒的稳定性

3.4.3转录方式的选择

3.5结论

第4章 PRRSV的复制子载体的研究

4.1研究目的与意义

4.2材料与方法

4.2.1细胞、菌株与质粒

4.2.2酶及主要试剂

4.2.3培养基与抗生素

4.2.4缓冲液

4.2.5 PRRSV复制子cDNA的连接

4.2.6 PRRSV复制子在BHK-21细胞内的表达

4.2.7动物试验

4.2.8 N-ELISA试验

4.2.9 EGFP-ELISA试验

4.2.10细胞免疫的检测

4.3结果

4.3.1 PRRSV复制子cDNA的构建

4.3.2 PRRSV复制子在BHK-21细胞内的表达

4.3.3免疫小鼠的模式基因(EGFP)的ELISA抗体水平

4.3.4免疫小鼠的复制子载体N蛋白基因的ELISA抗体水平

4.3.5实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达

4.4讨论

4.4.1 PRRSV复制子构建策略

4.4.2 PRRSV复制子疫苗载体体外表达特性

4.4.3病毒复子疫苗载体制增强免疫反应的作用机制

4.4.4 PRRSV复制子系统可能的应用领域

4.5结论

参考文献

致 谢

附 录