柑橘转GFP、AP1和LFY基因植株群体的分子鉴定与基因表达研究

摘要

转基因技术应用于改良农作物的特定性状,如耐除草剂、抗病性、抗虫性、抗环境胁迫、提高产量、改善品质等。还可以通过转基因植株超量或抑制特定基因的表达进行目的基因的功能验证。转基因植株能否广泛应用,其关键在于所转基因能否在遗传转化体内稳定整合和表达。
　　本研究以转GFP、AP1、LFY柑橘为材料,分析外源基因的拷贝数、T-DNA整合、甲基化和外源基因表达之间的相关性;采用Real-time PCR在转基因桠柑中筛选单拷贝的转基因植株,以验证Real-time PCR在拷贝数分析上的可行性;分析转AP1和LFY柑橘的外源基因拷贝数和表达,研究早花转基因植株外源AP1或LFY及内源开花基因的表达。
　　主要结果如下:1. Southern杂交分析118棵转基因植株外源基因的拷贝数。结果表明大部分转基因植株拷贝数为1-2个。转GFP基因8株冰糖橙中5株为多拷贝(拷贝数大于3),转AP1桠柑(43株)有超过一半植株为多拷贝;转GFP佛罗斯特脐橙、转AP1茶枝柑、转LFY改良橙与尾张有性杂种、转LFY冰糖橙的拷贝数均为1-2个;转GFP改良橙与尾张有性杂种和转AP1金柑各有一个株系为多拷贝,其它为1-2个拷贝。不同转基因柑橘株系中都有T-DNA整合缺失的出现,转AP1茶枝柑、转LFY冰糖橙各有一个株系的GUS基因缺失。2.转GFP柑橘荧光检测。转GFP基因佛罗斯特脐橙愈伤荧光稳定表达,在愈伤分化旺盛时绿色荧光表达较强。转GFP植株叶片荧光检测发现大部分转基因植株荧光正常表达,嫩叶荧光比老叶强;改良橙与尾张有性杂种有一个转基因株系荧光未检测到,即发生转基因沉默;一个株系的转基因冰糖橙荧光呈现斑驳化。3. Southern杂交和反向PCR分析转GFP柑橘的T-DNA整合情况。详细分析3个转GFP改良橙与尾张有性杂种株系,6个转GFP冰糖橙的T-DNA整合:在6棵多拷贝的转GFP植株中,4棵植株中有T-DNA正向重复的排列;3株转基因冰糖橙都有一个T-DNA正向重复,1株转基因沉默的改良橙与尾张有性杂种中发现至少两个T-DNA重复;进一步测序发现T-DNA重复的左右边界序列都有不同程度的缺失,而转基因的改良橙与尾张有性杂种的两个T-DNA重复中存在一个500 bp片段的缺失,缺失部分为Mos-pro和部分nptII序列。4.亚硫酸氢盐测序法分析转GFP柑橘的nptⅡ、GFP和CaMV35S启动子的甲基化程度。结果显示1-2个拷贝的转GFP柑橘外源基因和35S甲基化和质粒DNA甲基化程度类似;多拷贝转基因改良橙与尾张有性杂种其nptII序列有10％-20％的胞嘧啶甲基化,而该转基因植株的GFP和35S中胞嘧啶甲基化程度高达70％-90％,特别是CG和CNG类型的对称式的甲基化程度为90％。多拷贝转基因冰糖橙nptlI,GFP和CaMV35S启动子序列的甲基化分别为10％-40％,20％-60％和60％-80％。5.转基因柑橘外源基因表达。Northern杂交和Real-time RT-PCR分析nptII和GFP基因的表达,不同拷贝之间nptII表达没有差异,GFP在大多数多拷贝植株表达较低,转基因沉默植株GFP表达非常低;转LFY的改良橙与尾张有性杂种和冰糖橙的外源基因表达与拷贝数也没有相关性。6.Real-time PCR在转AP1桠柑中筛选单拷贝植株。Real-time PCR分析结果表明43个转基因桠柑中有11株单拷贝,与Southern结果一致。Real-time PCR法检测的相对拷贝数与Southern杂交结果的相关系数分别为:AP1,0.7521;GUS,0.5856;nptlI,0.8222。7.转AP1或LFY柑橘开花情况。5株转AP1金柑植株中1株移栽温室11个月开花(段艳欣,2006),在随后两年均正常开花;另有2株第二年开花,随后一年也正常开花;第三年,一个转基因株系表现为比对照植株晚花,其它转化或未转化植株均开花。3个转LFY的改良橙与尾张有性杂种2个株系早花移栽温室一年后开花;8个转LFY冰糖橙1株早花移栽温室两年后开花;其它转化和未转化植株都没开花。8.外源开花基因和内源开花基因的表达。转AP1金柑的不同开花植株中外源AP1表达各有差异,部分开花植株的内源CiLFY上调表达,而内源CiAP1在开花植株中下调表达。在转LFY的冰糖橙和改良橙与尾张有性杂种中,早花植株的外源LFY表达相对较高,大部分转基因植株表现为内源CiAP1上调表达和CiLFY下调表达。早花转基因金柑可能与CiFT、CiLFY的上调表达和CiTFL1的下调表达有关,晚花与CiAP1和CiTFL1上调表达和CiFT的下调表达相关。转LFY的冰糖橙和改良橙与尾张有性杂种的早花转基因株系都表现为CiFT、CiWUS和CiTFL1下调表达。其它内源开花基因在转基因植株间没有规律性的变化。
　　以上结果表明CiTFL1下调表达在调控转AP1或LFY柑橘开花时间上起着决定性的作用。本文还对外源基因拷贝数、T-DNA重复、启动子与外源基因甲基化对外源基因表达的影响,Real-time PCR分析拷贝数的可行性以及外源AP1和LFY与内源开花基因在调控花期中的相互作用进行了讨论。

目录

摘要

Abstract

缩略词表

1 文献综述

1.1 问题的提出

1.2 前人研究进展

1.2.1 影响外源基因表达的因素

1.2.2 木本植物外源基因稳定表达的相关研究

1.2.3 荧光蛋白简介

1.2.4 开花相关基因简介

1.3 本研究的目的和意义

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 转基因材料

2.1.2 外源基因质粒图

2.1.3 主要的生化试剂

2.1.4 所用主要培养基配方

2.2 实验方法

2.2.1 GFP检测

2.2.2 DNA提取

2.2.3 PCR检测

2.2.4 反向PCR检测

2.2.5 Southern blot检测

2.2.6 外源基因甲基化分析

2.2.7 植物总RNA提取

2.2.8 cDNA第一链合成

2.2.9 半定量RT-PCR检测

2.2.10 Real-time RT-PCR分析

2.2.11 Real-time PCR分析外源基因相对拷贝数

2.2.12 Northern blot检测

3. 结果与分析

3.1 转GFP柑橘外源基因表达的分析

3.1.1 转GFP柑橘的Southern杂交分析

3.1.2 转GFP柑橘的荧光检测

3.1.3 反向PCR分析转GFP柑橘的T-DNA重复

3.1.4 转GFP柑橘外源基因的表达分析

3.1.5 转GFP柑橘外源基因和35S的甲基化分析

3.2 转AP1柑橘外源基因拷贝数分析

3.2.1 转AP1基因的茶枝柑Southern杂交分析

3.2.2 转AP1椪柑的拷贝数分析

3.3 转AP1金柑的内源开花相关基因表达分析

3.3.1 转AP1基因金柑的Southern杂交

3.3.2 转AP1基因金柑的开花状况

3.3.3 转AP1基因金柑的开花相关基因的表达

3.4 转LFY柑橘外源基因和内源开花相关基因表达分析

3.4.1 转LFY基因柑橘的PCR和Southern分析

3.4.2 转LFY基因柑橘的开花状况

3.4.3 转LFY基因柑橘的外源基因表达

3.4.4 转LFY基因柑橘的外源LFY基因和内源开花相关基因的表达

4 讨论

4.1 多种转基因事件中外源基因拷贝数的差异分析

4.2 拷贝数与外源基因表达的关系

4.3 Real-time PCR用以单拷贝转基因植株筛选

4.4 T-DNA整合的缺失与重排

4.5 甲基化与外源基因表达

4.6 转基因沉默原因

4.7 AP1、LFY与内源开花相关基因的相互作用

5 展望

5.1 转基因沉默在柑橘育种上的应用

5.2 早花转基因植株后续研究

参考文献

攻读博士期间发表的论文

致谢