豆粕中胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其间接竞争酶联免疫吸附检测方法的研究

摘要

胰蛋白酶抑制剂(TI)是豆粕中重要的抗营养因子,它抑制人和动物肠道内胰腺分泌的蛋白水解酶活性,动物采食含TI的日粮后导致其采食量和日增重下降,饲料转化率降低,引起胰腺增生和肥大、生长停滞等问题。ELISA具有选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强等特点,弥补了经典化学法和其他仪器分析法的不足,目前在饲料安全性检测、质量评价中的研究和应用越来越多。
　　 本研究采用与胰蛋白酶偶联的CNBr-activated Sepharose4B通过一步亲和层析法分离纯化大豆TI,得到两个洗脱峰。酶化学方法检测1号峰比活力为2317TIU/mg,纯化倍数为原液的115倍；2号峰比活力为5657TIU/mg,纯化倍数为原液的283倍。经SDS-PAGE检测,2号峰表现为20KDa的单一条带,收集到的蛋白为KTI。1号峰没有条带出现,推测1号峰收集到的蛋白可能为BBI,因为BBI类抑制剂的分子量为6～10KDa,在大分子蛋白胶中未能显现条带。
　　 以大豆KTI为抗原采用足掌、腘窝淋巴结、背部及颈部皮下多点的综合免疫途径免疫新西兰兔,成功制备了高特异性的多克隆抗体。继而以此抗体为核心试剂,建立了间接竞争ELISA检测方法,标准曲线线性方程为:y=20.841x+50.961,R2=0.9941。选择0.05mol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液为样品浸提液,将KTI纯品以0.8μg/ml,1.6μg/ml,2.4μg/ml的浓度分别添加到豆粕中,其回收率为93.7％～104.9％,变异系数为2.8％～5.1％。经不同热处理的大豆粉及KTI纯品用酶化学方法和本方法对比后呈现较好的一致性。
　　 本研究方法特异性和准确度较高,为发酵豆粕产品的质量稳定提供可靠的监控手段,同时也为饲料企业对发酵豆粕产品的选择提供分析方法。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 研究背景

1.2 国内外研究现状

1.2.1 大豆TI的性质

1.2.2 TI的抗营养作用机制

1.2.3 TI的分离纯化

1.2.4 TI的检测方法

1.3 研究目的及意义

第二章 大豆KTI的分离纯化

2.1 材料

2.1.1 原料

2.1.2 试剂

2.1.3 试验仪器

2.2 方法

2.2.1 亲和层析柱的制备

2.2.2 TI粗提液的制备

2.2.3 TI亲和层析纯化

2.2.4 蛋白浓度的检测

2.2.5 活性检测

2.2.6 SDS-PAGE检测

2.3 结果与分析

2.3.1 亲和层析柱的制备

2.3.2 亲和层析

2.3.3 TI活性检测

2.3.4 SDS-PAGE检测

2.4 讨论

第三章 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 材料

3.1.1 试验原料和动物

3.1.2 试剂

3.1.3 试验仪器

3.2 方法

3.2.1 免疫

3.2.2 盐析法纯化抗体

3.2.3 抗体特异性检测

3.2.4 间接竞争ELISA条件的优化

3.2.5 间接竞争ELISA标准曲线的建立

3.2.6 灵敏度的测定

3.2.7 精密度的测定

3.2.8 样品浸提条件的确定

3.2.9 准确度的测定

3.2.10ELISA和酶化学方法测样结果的比较

3.3 结果与分析

3.3.1 抗血清效价的测定

3.3.2 抗体特异性检测

3.3.3 ELISA条件的优化

3.3.4 标准曲线的建立

3.3.5 灵敏度的确定

3.3.6 精密度的测定

3.3.7 样品的前处理

3.3.8 回收率的测定

3.3.9 EIASA与酶化学方法的比较

3.4 讨论

3.4.1 多克隆抗体的制备

3.4.2 ELISA

3.4.3 ELISA与酶化学方法的对比

参考文献

致谢