结核分枝杆菌单链DNA结合蛋白突变文库的建立及初步应用

摘要

结核分枝杆菌(M. tuberculosis)是一种严重危害人类健康的病原细菌，它们在与宿主细胞相互作用过程中呈现出活跃生长-潜伏-复苏等多种生长模式，这表明，其DNA代谢可能受到严谨的调控。单链DNA结合蛋白（SSB）能够广泛参与诸如DNA复制，重组，修复等多种生化过程，但是结核分枝杆菌的SSB的功能还没有深入研究，其关键氨基酸残基还没有鉴定。
　　针对结核分枝杆菌的基因组GC含量高的特点，本研究采用重亚硫酸氢钠化学诱变剂随机突变其单链DNA结合蛋白（MtuSSB）基因Rv0054，成功构建了点突变文库。在随机挑选的830个突变体中，814个测序成功，共获得了单氨基酸突变体123个。另外还获得了双突变体107个，三突变体63个，四突变体44个，和C-末端缺失体13个。这些突变覆盖了SSB基因的141个氨基酸位点，覆盖率达到93.4%(141/151)。从该SSB突变文库中选择了22个进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和细菌双杂交等分析，初步鉴定到了8个影响多聚体状态的突变位点。
　　这是第一次建立高覆盖率的结核分枝杆菌H37Rv单链DNA结合蛋白氨基酸位点突变文库，这对于进一步系统剖析该蛋白质的功能及结构与功能的关系创造了条件。同时，该方法的建立和成功实践也将为深入研究结核分枝杆菌的其它关键基因搭建了主要技术平台。

目录

声明

缩略语

第一章 前言

1 研究单链DNA结合蛋白的重要意义

2 随机突变技术

3 研究蛋白质多聚体或者蛋白质间相互作用的方法

4 聚丙烯酰胺凝胶阻滞迁移分析（EMSA）

5 微生物单链DNA结合蛋白的研究进展

6 结核分枝杆菌单链DNA结合蛋白(MtuSSB)的研究进展

7 本课题的意义，内容和研究目标

第二章 材料与方法

1 材料

2 方法

第三章 结果与分析

1 MtuSSB的克隆，表达纯化和活性验证

2 MtuSSB突变文库的建立

3 功能实验分析

第四章 总结与讨论

1 总结

2 讨论

3 研究展望

参考文献

附录

致谢