端粒单链DNA结合蛋白的分离纯化及hpot1外显子14突变分析

摘要

【目的】 建立一种新的人端粒单链DNA结合蛋白分离纯化和鉴定的方法，并尝试从人类HeLa细胞中鉴定出新的人端粒单链DNA结合蛋白；对临床肿瘤组织标本的人端粒保护蛋白(human protection of telomeres 1,hPOT1)基因外显子14突变位点进行突变分析。 【方法】 1．新的人类端粒单链DNA结合蛋白分离纯化和鉴定的方法的建立 从培养的HeLa细胞核中分离得到核蛋白，设计(TTAGGG)<,5>模拟一段端粒单链DNA结构，端粒单链DNA结合蛋白与这段探针序列能特异的结合，采用生物素一链霉素磁珠法分离纯化核蛋白得到部分纯化的端粒单链DNA结合蛋白，通过EMSA(电泳迁移率改变分析)检测纯化效果；通过SDS-PAGE进一步分离纯化部分纯化的端粒单链DNA结合蛋白，考马斯亮兰染色显示蛋白带，进而对每个蛋白带进行胶内酶切联合飞行时间质谱(TOF-MS)分析得到肽谱，并鉴定出新的人端粒单链DNA结合蛋白。 2．hPOT1基因外显子14突变位点分析 收集各种临床肿瘤标本，提取基因组DNA，PCR扩增hpot1外显子14序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，柱纯化后进行DNA测序，将测序结果与野生型外显子14序列对比，鉴定出基因突变标本。 【结果】 采用先溶胀细胞分离细胞核、再通过皱缩裂解细胞核方案，能迅速高效的分离得到总核蛋白；生物素一链霉素磁珠法能有效地纯化人粒单链DNA结合蛋白，得到部分纯化的端粒单链DNA结合蛋白；部分纯化的端粒单链DNA结合蛋白经EMSA检测能清晰的显示出滞后带(端粒单链DNA结合蛋白带)；试图通过SDS-PAGE进一步分离纯化部分纯化的端粒单链DNA结合蛋白，仅能显示出较弱的考马斯亮兰染色蛋白带，未能达到进行胶内酶切联合飞行飞行时间质谱(TOF-MS)分析要求，故未能鉴定出新的端粒单链DNA结合蛋白，因此，该方案有待改进。本课题组自行设计的hpot1外显子14引物，能从临床各种肿瘤标本通过 PCR扩增出清晰的目的片段，扩增产物经柱纯化后能直接测序；共收集临床各种肿瘤标本20例，筛选出hpot1外显子14突变肿瘤标本1例。 【结论】 初步建立了一种全新的基于生物素-链霉素磁珠法的人类端粒单链DNA结合蛋白分离纯化方法，该方法系本课题组自行设计的一种全新的方法，文献未见类似报道，但方案有待改进和完善；建立了基于PCR和测序技术的hpot1外显子14 突变分析方法，并成功筛选出基因突变肿瘤标本1例。

目录

声明

1前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2端粒单链DNA结合蛋白分离和鉴定的初步研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

3肿瘤组织pot1 外显子14突变的检测

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

4 小结

参考文献

综述一：人端粒保护蛋白1（hPOT1)保护和调节端粒长度机制

综述二：NPC1L1：固醇脂质吸收的关键蛋白

致谢

附录