猪胚胎期五个基因的分离、印记鉴定及甲基化分析

摘要

印记基因是指来自双亲的两个等位基因的表达具有倾向性,只表达一个亲本的,另一个亲本的不表达或者表达量很低的一类基因。它们对哺乳动物胚胎的生长、发育、胎盘的功能以及繁殖性状等方面起着重要作用。印记基因不但调控一些与质量性状相关的基因的表达,而且还影响许多数量性状的表型方差和表型值。全基因组扫描发现许多QTLs是父本或者母本印记的,它们与生长、背膘厚、胴体组成和繁殖性状相关。与人和鼠中印记基因的研究相比,在猪中对印记的研究很少。因此,在猪中鉴定新的印记基因非常重要,这不但可以完善家畜中印记基因的研究,而且可以加强基因组印记在不同物种中的比较基因组学分析。
　　 本研究利用RT-PCR-RFLP和直接测序的方法,鉴定了5个基因在妊娠30天、65天和100天胚胎中的印记状态。运用RCR-RFLP,检测了4个基因的SNP,以及其在不同品种中的等位基因频率,并且将这些多态位点与大白猪和梅山猪交配的F2代群体的胴体性状和肉质性状进行了关联分析。运用荧光定量和半定量RT-PCR的方法分析了目的基因的组织表达情况。获得4个基因的启动子序列,并对其中2个基因的启动子活性进行分析,且分析了其CpG岛的甲基化情况,具体结果如下:
　　 1.分离克隆了猪DIO3、RTL1、DIRAS3和COPG2基因,都包含完整的开放阅读框(ORF),预测的氨基酸序列与人和鼠具有很高的相似性。
　　 2.利用RT-PCR-RFLP和PCR直接测序的方法,在大白猪与梅山猪正反交产生的30 d、65 d和100 d胚胎中检测了DIO3、RTL1、NNAT、DIRAS3和COPG2基因的印记状态:DIO3、RTL1和DIRAS3基因在30 d胚胎、65 d和100 d胚胎的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、肌肉、脑和胎盘组织都表现为父本表达；NNAT基因在65 d和100 d胚胎的脾脏组织中为双表达,其余组中都是父本表达；COPG2基因在各个阶段都是双表达的。
　　 3.用荧光定量PCR方法检测了DIO3基因在二月龄大白母猪不同组织中的表达情况,在脂肪组织中表达量最高。用半定量RT-PCR的方法检测了RTL1基因在大白猪65d胚胎的13个组织中的表达情况,在小肠、股二头肌和半腱肌中表达量较高；利用用荧光定量PCR的方法检测其在两个猪种(梅山猪和大白猪)的4个发育阶段(胚胎60 d,出生后35,60和120天)的三种类型的肌肉(背最长肌、股二头肌和半腱肌)中的表达情况；并且用半定量RT-PCR的方法检测了其随着C2C12细胞分化的表达量降低。检测到猪COPG2基因存在五个不同的转录本,分别命名为COPG2—1、COPG2-2、COPG2-3、COPG2-4和COPG2-5,利用半定量RT-PCR的方法分析了不同转录本在猪胚胎期65 d和出生后二月龄各10个组织中的表达情况。
　　 4.利用数据库中已有序列,设计引物PCR扩增获得了猪RTL1、NNAT和DIRAS3基因的启动子序列,利用基因组步移的方法获得了猪LCAT基因的启动子序列。发现RTL1和NNAT基因启动子区存在许多与肌肉发育相关的转录因子结合位点,如MyoD、YY1及NF-kappaB等,并且双荧光素酶报告基因系统检测了RTL1和NNAT基因的启动子活性。对RTL1和NNAT基因的启动子区的CpG岛进行了预测,并且用亚硫酸氢盐测序法对其甲基化状态进行了分析,初步推测NNAT基因的启动子区的两个CpG岛可能是差异甲基化区。
　　 5.利用PCR-RFLP技术,对DIO3、RTL1、NNAT和COPG2基因中的SNP位点在不同品种猪中进行了基因分型,并在大白猪和梅山杂交产生的F2代群体中进行了性状关联分析。结果表明(1)DIO3基因外显子A687C位点与瘦肥肉比率、肥肉率、瘦肉率、板油重、肩部膘厚、6-7腰椎间膘厚、臀部膘厚、眼肌面积、背最长肌含水量、背最长肌失水率、背最长肌系水力、背最长肌肌肉色值、股二头肌肌肉色值、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹呈显著相关(P<0.05),与肌内脂肪含量呈极显著相关(P<0.01)；(2)RTL1基因外显子G1209A位点与皮率、内脂率、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、背最长肌pH、股二头肌肌肉色值呈显著相关(P<0.05),与骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最长肌失水率、背最长肌系水力、背最长肌肌肉色值呈极显著相关(P<0.01)；RTL1基因外显子A3929G位点与内脂率、肩部膘厚、眼肌高、眼肌面积、背最长肌含水量、背最长肌肌肉色值、背最长肌肌内脂肪量显著相关(P<0.05),与皮率、背最长肌失水率、背最长肌系水力、股二头肌肌肉色值呈极显著相关(P<0.01)；(3)NNAT基因启动子A-107G位点与眼肌高、眼肌宽、眼肌面积、背最长肌含水量、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹呈显著相关(P<0.05)；COPG2基因3’UTR区G/A突变与肥肉率、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最长肌pH、股二头肌pH、头半棘肌pH显著相关(P<0.05)。