猪链球菌2型fbps基因突变株的构建及其生物学特性的研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是导致猪链球菌病主要的病原菌。该菌可分为33个血清型，其中猪链球菌2型(Streptococcus suis type2，SS2)致病性强、流行最广泛并且在临床上，该型是分离率最高的血清型之一。SS2可引起猪的脑膜炎、化脓性肺炎和心肌炎等疾病。SS2可通过直接感染特定从业相关人群，严重的病例发生中毒性休克综合症，导致多脏器衰竭及死亡，是一种重要的人畜共患病。近几年猪链球菌病的几次爆发流行，因此SS2成为了国内外广泛关注和研究的热点，尤其是关于其致病和免疫防治。
　　 SS2对宿主的粘附过程可能是其致病过程中一个关键的步骤。SS2和宿主细胞的粘附并非一个简单的过程，在细菌和细胞表面都有多种相关因子参与了此过程，因此研究在此过程中发挥作用的关键因子可能会对SS2致病机理阐释发挥重要作用。
　　 猪链球菌2型基因组中的fbps基因编码了一种具有纤连蛋白结合位点的表面膜蛋白(fibronectin binding proteins，FBPS)，和它具有同源性的同样具有Fn结合活性的蛋白在其他链球菌的感染中发挥着关键的作用，因此推断，FBPS可能是猪链球菌感染的吸附过程中的一个重要的参与蛋白。
　　 在此背景之下，我们以SS2高致病性菌株SC19作为亲本菌株，以纤连蛋白结合蛋白编码基因作为研究对象，构建了fbps基因的缺失突变株，并在此基础上分析fbps基因的缺失对SS2基本生物学性状以及对致病力的影响，主要研究内容包括：
　　 1温敏型自杀性重组质粒的构建
　　 以2005年四川分离的SS2高致病性菌株SC19为亲本菌株，分别扩增fbps基因的780bp上游序列和81bp的下游序列，并利用融合PCR的方法获得上下游同源臂全长片段并连接到pMDx-18T载体，构建克隆载体pMDx-18T-f，分别用EcoR1和BamH1同时酶切pMDx-18T-f和pSET4s载体后连接，构建自杀性重组转移质粒pSET4s-fbps。
　　 2纤连蛋白结合蛋白fbps基因突变株的构建
　　 将重组质粒pSET4s-fbps电转化亲本菌株SC19感受态细胞，以壮观霉素抗性标记和温度敏感双重筛选，得到fbps基因缺失突变菌株。并进一步通过PCR等方式对筛选出的突变菌株进行验证。
　　 3纤连蛋白结合蛋白fbps基因突变株生物学性状的研究
　　 在构建的fbps基因突变株的基础上，研究缺失菌株的遗传稳定性，体外生长和增殖的能力等生物学性状。结果表明，连续传代十代突变株均能稳定遗传。野生株和突变株的生长没有显著的差异，fbps基因的缺失不会影响SS2的生长和繁殖的速度。
　　 4 fbps对宿主的吸附侵入以及毒性作用
　　 以Hep-2细胞为模型，对比研究fbps缺失菌株和SC19野生型菌株粘附能力和侵入能力，以培养液中LDH的渗出为参照，测定培养液中LDH含量，比较突变株和野生菌株对细胞毒性作用。结果表明，fbps基因缺失突变株对Hep-2细胞的粘附能力和亲本株SC19相比下降了78%；对细胞侵入能力下降23%；测定LDH的浓度发现fbps基因突变株比野生型的毒性降低了32%。
　　 5突变株致病性研究
　　 将野生型菌株SC19和fbps基因缺失突变株分别以107cfu/ml，108cfu/ml和109cfu/ml的剂量腹腔注射昆明鼠(1ml)。结果显示，注射突变株的死亡率远远低于注射野生型SC19菌株的试验组。不同时间点剖杀小鼠不同器官的细菌动态分布表明，缺失了fbps基因导致细菌的组织定植能力显著下降。病理组织学观察发现SS2 fbps基因缺失突变株和野生型在小鼠中病变范围类似，主要引起肺部，脑部和心脏的病变，但是突变株引起的病变程度较轻微，说明fbps基因缺失突变株致病性显著降低。

目录

文摘

英文文摘

略语表

第一章 文献综述

1.1 猪链球菌病和链球菌毒力相关因子研究进展

1.1.1 前言

1.1.2 病原学

1.1.3 流行病学

1.2 纤连蛋白及纤连蛋白结合蛋白概述

1.2.1 细胞外基质(Extracellular matrices，ECM)

1.2.2 纤连蛋白(Fibronectin，Fn)

1.2.3 整联蛋白(integrin)

1.2.4 链球菌吸附

1.2.5 纤连蛋白结合蛋白研究进展

第二章 材料和方法

2.1 研究目的

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株

2.2.2 细胞株

2.2.3 质粒

2.2.4 主要生化试剂

2.2.5 培养基的配制

2.2.6 质粒抽提相关溶液

2.2.7 其他缓冲液及试剂

2.2.8 实验动物

2.2.9 链球菌的培养

2.2.10 PCR

2.2.11 猪链球菌2型fbps基因上下游同源臂的扩增

2.2.12 PCR产物或者酶切产物的纯化与回收

2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.2.14 连接反应

2.2.15 连接产物的转化

2.2.16 质粒的制备

2.2.16 重组质粒的酶切鉴定

2.2.17 链球菌的电转化

2.2.18 基因缺失突变种的筛选

2.2.19 基因缺失菌株的抗性筛选

2.2.20 突变株遗传稳定分析

2.2.21 突变株生长特性研究

2.2.22 细胞粘附实验

2.2.23 细胞侵入试验

2.2.24 细胞毒性试验

2.2.25 pET-28a(+)重组表达质粒的构建

2.2.26 pET-28a(+)重组质粒的酶切鉴定

2.2.27 蛋白诱导表达

2.2.26 蛋白纯化

2.2.28 Western Blot

2.2.29 突变株对小鼠致病力试验

2.2.30 动物实验

2.2.30 病理学检查

2.2.31 统计处理

第三章 实验结果

3.1 猪链球菌2型fbps基因的克隆与序列分析

3.2 猪链球菌2型fbps基因缺失突变菌株的构建

3.2.1 自杀性质粒pSET4s-fbps的构建和鉴定

3.2.2 猪链球菌2型fbps基因缺失菌株的重组鉴定

3.3 猪链球菌2型fbps基因缺失菌株的生物特性研究

3.3.1 猪链球菌2型fbps基因缺失菌株的遗传稳定性分析

3.3.2 猪链球菌2型fbps基因缺失菌株生长特性试验

3.4 Fbps基因突变株对细胞的粘附侵入和毒性研究

3.4.1 Fbps基因突变株对Hep-12细胞的粘附

3.4.2 Fbps基因突变株对Hep-2细胞的侵袭

3.4.3 Fbps基因突变株对Hep-2细胞的毒性

3.5 Fbps基因缺失突变菌株对小鼠的毒力试验

3.5.1 Fbps基因缺失突变对SS2致病力的影响

3.5.2 Fbps基因缺失突变株和野生型菌株攻毒后动态分布

3.5.3 N病理学检查

第四章 讨论

4.1 猪链球菌和猪链球菌病

4.2 猪链球菌和宿主的相互作用

4.3 目标基因的选择

4.4 突变株的构建

4.5 SS2突变株的研究

4.6 FBPS对粘附和侵入的影响

4.7 猪链球菌2型fbps基因突变株生物学特性

4.8 FBPS对小鼠的致病力的影响

4.9 小鼠病理学变化

第五章 结论

参考文献

附录

个人简历

致谢