猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2‑1ΔRex及其构建方法和应用

摘要

本发明提供猪链球菌2型Rex基因敲除突变株及其构建方法和应用，属于基因工程领域。突变株SS2‑1ΔRex，是将SS2‑1株基因组中Rex编码基因敲除后获得的。突变株SS2‑1ΔRex的构建方法：构建含有同源重组片段的基因敲除质粒 pSET4s::Rex，将 pSET4s::Rex电转化入SS2‑1株内，同源重组，采用抗性筛选；所述同源重组片段的两侧为SS2‑1株基因组中Rex编码基因上、下游片段，中间为抗性基因片段。突变株SS2‑1ΔRex，毒力较亲本株显著降低，构建方法简单、高效，突变株SS2‑1ΔRex的活疫苗，仅需接种两次，就能够有效控制SS2的感染，没有明显的毒副反应。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及猪猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex及其构建方法和应用。

背景技术

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，主要引起仔猪败血症和脑膜炎等，给全球养猪业造成巨大的经济损失。近年来，猪链球菌临床分离株表现出对人类和猪更严重的致病性，导致人们担心毒力更强的猪链球菌的出现。在已知的33个血清型中，以猪链球菌2型(Streptococcus>type 2, SS2)流行最广，致病性最强，危害最重。猪链球菌通常定居在感染猪的上呼吸道、扁桃体、鼻腔以及肠道。1998年和2005年在我国江苏南通和四川资阳两次暴发了由猪链球菌2型引起的猪链球菌感染疫情，给公共卫生安全造成了极大的危害，受到全世界的广泛关注。但是，目前关于S.suis感染宿主并致病的分子机制尚不明确。

疫苗作为一种安全有效的病原菌防控手段成为当今应对SS2感染的研究热点。现有灭活疫苗，需多次接种、接种剂量大、接种后易产生局部或全身毒、副反应，且保护作用欠佳。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex，毒力较亲本株显著降低。

本发明的另一目的是提供猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex的构建方法，该方法简单、高效。

本发明的再一目的是提供猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex在制备猪链球菌病疫苗中的应用，采用突变株SS2-1ΔRex的活疫苗，仅需接种两次，就能够有效控制SS2的感染，没有明显的毒副反应。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex，是将猪链球菌2型SS2-1株基因组中Rex编码基因敲除后获得的，所述Rex编码基因的核苷酸序列如SEQ>

在本发明中，所述Rex编码基因是通过同源重组方法敲除、且被抗性基因替代了。

在本发明中，所述抗性基因为氯霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供所述猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex的构建方法，包括如下步骤：构建含有同源重组片段的基因敲除质粒>

优选的技术方案中，构建含有同源重组片段的基因敲除质粒 pSET4s::Rex的方法包括如下步骤：

（1）以猪链球菌2型SS2-1株基因组DNA为模板，分别扩增Rex编码基因上、下游片段；以pSET3为模板，扩增氯霉素抗性基因片段；

（2）将Rex编码基因上、下游片段和氯霉素抗性基因片段依次插入质粒pSET4s中，Rex编码基因上、下游片段分别位于氯霉素抗性基因片段两侧。

在本发明中，Rex编码基因上游片段的扩增引物为LA1和LA2，Rex编码基因下游片段的扩增引物为RA1和RA2，氯霉素抗性基因片段的扩增引物为CAT1和CAT2，LA1、LA2、RA1、RA2、CAT1和CAT2序列分别如SEQ ID NO：3～8所示。

本发明还提供所述猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex在制备猪链球菌病疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

用猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex进行动物实验，结果发现细菌的毒力显著下降，制成活疫苗后进行动物免疫，保护效果比亲本株灭活疫苗显著好，为减毒疫苗的开发提供了重要价值。猪链球菌2型Rex基因敲除突变株活疫苗仅需接种两次，就能够有效控制SS2的感染，没有明显的毒副反应。本发明突变株SS2-1ΔRex的构建方法，简单高效。SS2-1ΔRex为进一步研究猪链球菌2型的致病机制奠定了基础，为更有效的防控猪链球菌病提供了技术支持。

附图说明

图1为基因同源重组示意图。

图2显示了SS-1△Rex株的组合PCR鉴定结果，其中1、2:以RexP1/RexP2为引物PCR扩增产物; 3、4:以CAT1/CAT2为引物的PCR扩增产物; 5、6:以OUT1/CAT2为引物的PCR扩增产物 ; 7、8:以OUT2/CAT1为引物的PCR扩增产物; 9、10:以OUT1/OUT2为引物的PCR扩增产物; 1、3、5、7、9的扩增模板是SS2-1株; 2、4、6、8、10的扩增模板是SS-1△Rex株。

图3为突变株SS2-1ΔRex的生长曲线图。

图4为BALB/c小鼠腹腔注射亲本株和基因敲出突变株SS2-1ΔRex之后的存活曲线图。

具体实施方式

本发明中使用的材料：

1.Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、EcoR>BamH>Sal>I、Hind>

2.质粒载体pSET4s ，公开的论文信息为Takamatsu D, Osaki M, Sekizaki T:Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus>.Plasmid 2001, 46(2):140-148。

质粒pSET3 ，公开的论文信息为Tsutomu Sekizaki et al. Construction andCharacterization of Streptococcus suis-Escherichia coli Shuttle CloningVectors, Plasmid,2001,45:101-113。

3.质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Promega公司（美国）。

4.酵母提取物、胰蛋白胨和Todd-Hewitt Broth(THB)培养基购自Oxoid公司产品（英国）。

5.培养基：LB液体培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于1000mL去离子水中，高压蒸气灭菌。LB固体培养基：每1000ml液体LB培养基中加入15g琼脂粉，高压蒸气灭菌。THB液体培养基：称取THB粉3g，溶于100mL去离子水中，高压蒸气灭菌。THB固体培养基：每100mL液体THB培养基中加入1.5g琼脂粉，高压蒸气灭菌。复苏液：每100mLTHB液体培养基中加入10.268g蔗糖，高压蒸气灭菌。

6.壮观霉素、氯霉素购自Sigma公司。

7.Gene Pulser Xcell^TM型电穿孔仪购自BIO-RAD公司。

实施例1 基因敲除载体pSET4s::Rex的构建

本实施例描述了构建基因敲除载体pSET4s::Rex的步骤。Rex是猪链球菌2型SS2-1株的转录调节因子，Rex编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。同源重组片段：氯霉素抗性基因Cat^Ｒ（核苷酸序列如SEQ>

(1)引物设计：根据猪链球菌2型SS2-1株（强毒株）基因组中Rex编码基因的上下游DNA序列设计两对PCR引物，引物LA1和LA2用于扩增Rex编码基因的上游片段，引物RA1和RA2用于扩增Rex编码基因的下游片段。各引物的序列如下：

LA1（SEQ ID NO:3）：5’->AACTAGATTTGGCAGGTATT-3’(下划线处为引入的HindIII酶切位点)，

LA2（SEQ ID NO:4）：5’->TTTAGACTCCTTTATTTCGATA-3’(下划线处为引入的Sal>I酶切位点)。

RA1（SEQ ID NO:5）：5’->GCAATGAAAAAACCAGTTAT-3’(下划线处为引入的BamH>

RA2（SEQ ID NO:6）：5’->CATCGTTCATAACCACCC-3’(下划线处为引入的EcoR>

引物CAT1和CAT2用于从pSET3质粒中扩增氯霉素抗性基因（Cat^Ｒ），在引物CAT1和CAT2中分别引入BamH>Sal>I的酶切位点。引物CAT1和CAT2的序列如下：

CAT1（SEQ ID NO:7）：5’-> TAATTCGATGGGTTCCGAGG-3’ (下划线处为引入的Sal>I酶切位点) ，

CAT2（SEQ ID NO:8）：5’-GGATCC>BamHI酶切位点)>

(2)PCR扩增

以猪链球菌2型SS2-1株基因组DNA为模板，用引物LA1和LA2进行PCR扩增，获得Rex编码基因上游片段LA；用引物RA1和RA2进行PCR扩增，获得Rex编码基因下游片段RA；以pSET3质粒为模板，用引物CAT1和CAT2扩增氯霉素抗性基因（Cat^Ｒ）。

PCR的反应体系为：

模板(SS2-1株基因组DNA或pSET3质粒)2μL

上游引物(LA1或RA1或CAT1)4μL

下游引物(LA2或RA2或CAT2)4μL

dNTP(10mM each) 2μL

10×PCR buffer10μL

MgCl₂(25mM)>

Ex Taq DNA聚合酶1μL

ddH₂O>

Total 100μL

PCR反应条件为：第一阶段94℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分钟，循环25次；第三阶段72℃延伸10分钟。上游片段LA的PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约888bp的目的条带，下游片段RA的PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约860bp的目的条带。氯霉素抗性基因PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1056bp的目的条带。将各PCR产物回收、纯化。

(3)LA的克隆：LA片段和pSET4s载体分别采用Hind>Sal>I双酶切，两酶切片段在16℃过夜进行连接，然后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，采用含有壮观霉素的LB平板进行筛选，挑取单克隆培养于含有壮观霉素的LB液体培养基中，37℃、振荡条件下培养过夜。次日提取质粒DNA，用Hind>Sal>I进行双酶切鉴定，阳性重组质粒酶切产物电泳后出现888bp左右大小的DNA片段，将阳性重组质粒命名为pSET4-LA。

(4)RA的克隆：RA片段和重组质粒pSET4s-LA分别采用BamH>EcoR>BamH>EcoR>

(4)氯霉素抗性基因Cat^Ｒ的克隆：氯霉素抗性基因扩增片段和重组质粒p>BamH>Sal>I进行双酶切，两酶切片段在16℃过夜进行连接，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，采用含有壮观霉素和氯霉素的LB平板进行双重筛选，挑取单克隆培养于含有壮观霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、振荡条件下培养过夜。次日提取质粒DNA，用BamH>Sal>I进行双酶切鉴定，阳性重组质粒酶切产物电泳后出现1100bp左右大小DNA片段，将阳性重组质粒命名为基因敲除载体pSET4s::Rex。

(5)基因敲除载体pSET4s::Rex的确认：将基因敲除载体pSET4s::Rex进行测序，测序结果表明在Cat^Ｒ基因两侧分别为Rex编码基因上、下游片段，载体pSET4s::Rex的构建完全正确。

实施例2 猪链球菌2型Rex基因敲除突变株的构建、筛选与鉴定

(1)电转化：将构建好的基因敲除载体pSET4s::Rex电转化猪链球菌2型SS2-1株感受态细胞。首先将猪链球菌2型SS2-1株感受态细胞于冰上放置，同时将直径1 mm 的电转杯冰上预冷，取10μL pSET4s::Rex质粒加入感受态细胞中。吸取质粒和感受态细胞的混合物贴壁加入电转杯中。在2.5kV/Cm，200Ω，25μF 的电转化参数下电击，电击结束后，向电击杯中加入复苏液900µL，吸出电击后的感受态细胞，加入盛有复苏液的试管中，28℃振荡培养2-3h。将菌液涂布于含有壮观霉素的THB平板上，在37℃条件下培养24-48小时，同源重组片段与SS2-1株基因组DNA进行同源重组，目的基因Rex编码基因被抗性基因>^R所取代，同源重组的原理见图1。

(2)筛选：从含有壮观霉素的THB平板上挑取猪链球菌单菌落，分别接入2ml液体THB培养基，在37℃条件下培养24小时，然后各取2μL菌液作为模板，采用引物RexP1和RexP2(用于扩增Rex编码基因)进行PCR扩增，筛选猪链球菌2型Rex基因敲除突变株。

引物RexP1和 RexP2的序列如下：

RexP1：5’-GTGAAAAACGATAAAAAATCTGATA-3’，

RexP2：5’-TTATCCTTTTCGCATAAAGTAGAGT-3’。

如果Rex编码基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小(639bp)的产物，说明Rex基因未被敲除。通过这种方法，初步筛选获得Rex基因敲除突变株，将其命名为SS2-1ΔRex。

(3)鉴定：组合PCR鉴定突变株SS2-1ΔRex

在SS2-1株Rex编码基因上、下游片段LA和RA的外侧再设计一对引物OUT1和OUT2。引物的序列如下：

OUT1：5’-GAATGGGGAGAAATCAAACGAGTG-3’ ，

OUT2：5’-AACAAGATCCGTTGCTTCTCCATC-3’。

以突变株SS2-1ΔRex基因组DNA为模板，采用如下引物对进行PCR鉴定：OUT1和CAT2、 OUT2 和CAT1、CAT1和CAT2、OUT1和OUT2，以SS2-1株基因组DNA为模板的扩增结果为对照。结果：以突变株SS2-1ΔRex基因组DNA为模板，用引物OUT1和CAT2能够扩增出2139 bp的片段，用引物CAT1和OUT2能扩增出1892 bp的片段，用引物CAT1和CAT2能扩增出Cat^Ｒ基因，用OUT1和OUT2能够扩增出3032bp的片段。而以SS2-1株基因组DNA为模板，用前三对引物进行PCR扩增，结果都为阴性，用OUT1和OUT2能够扩增出2615bp的片段。以SS2-1株基因组DNA为模板，用引物RexP1和RexP2能扩增出639bp的目的片段。结果见图2。将SS2-1ΔRex的各扩增片段经DNA测序验证（英俊测序），序列正确，在基因水平上证实，SS2-1株的Rex编码基因被抗性基因>^R所取代，SS2-1△Rex突变株构建成功。

实施例3突变株SS2-1△Rex的生长特性

取20μL猪链球菌2型SS2-1株和Rex基因敲除突变株SS2-1△Rex接种于THB 液体培养基中，在37℃条件下振荡培养，每隔1h 测OD₆₀₀值，重复实验3次并绘制生长曲线（图3）。从图3可以看出，亲本株与突变株生长速率相近，生长情况相仿，并无显著差异，说明Rex编码基因被抗性基因>^R所替代不会影响其生长。

实施例4 突变株SS2-1ΔRex的致病性

为了检测突变株SS2-1ΔRex的致病性，挑取猪链球菌2型SS2-1株和突变株SS2-1ΔRex的单菌落分别接种于THB液体培养基中，在37℃、180 r/min条件下振荡培养过夜。然后按照1%的接种量，转接至新鲜THB液体培养基中，37 ℃、180 r/min 振荡培养到OD₆₀₀为0.8，将菌液浓度调到8.0×10⁶>6>6>

实施例5 突变株SS2-1ΔRex活疫苗对小鼠的免疫保护实验

把40只4周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。第1组小鼠为突变株SS2-1ΔRex免疫组，免疫两次，第一次免疫每只小鼠腹腔注射1 mL突变株SS2-1ΔRex菌液（2×10⁶CFU/mL），14天后以同样的剂量再次免疫。第2组小鼠作为阳性对照组，免疫SS2-1株灭活疫苗。SS2-1株灭活疫苗是将灭活的SS2-1株菌液（4×10⁶CFU/mL）与弗氏佐剂等体积混合、乳化后制成的。第2组小鼠，免疫2次，第一次免疫，每只小鼠腹腔注射1>

4组小鼠全部免疫完成后，每组小鼠腹腔注射致死剂量（8.0×10⁶>

实验结果：由于没有疫苗的免疫保护，第3组与第4组小鼠在接入致死剂量的SS2-1株菌液后，5天内全部死亡。第2组小鼠在SS2-1株灭活疫苗的免疫保护下，存活率达60％。第1组小鼠得到突变菌株SS2-1ΔRex的免疫保护，小鼠存活率为90％。除此之外，所有阴性对照组和空白对照组的小鼠都表现出明显的临床症状，例如被毛粗糙零乱，刺激反应迟缓等现象，然而使用突变株SS22-1ΔRex免疫的存活小鼠没有表现出任何临床症状。

实验结果表明：突变株SS2-1ΔRex的免疫效果比亲本株灭活疫苗的免疫效果显著好，采用突变株SS2-1ΔRex免疫过的小鼠抵抗力强，再次受到亲本株感染后保护率达到90％。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪链球菌2型Rex基因敲除突变株SS2-1ΔRex及其构建方法和应用

<130> 20161124

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型SS2-1株

<400> 1

gtgaaaaacg ataaaaaatc tgatattcca cgcgctactg ccaaacgtct atccctctac 60

tatcgcattt ttaaacgttt ctatgcagga aatattgaaa aagctagttc aaaagaaatt 120

gccgaagcta tcggaatcga ttcagctacc gtccgccgag atttttccta ttttggagag 180

cttggtcgtc gtggctttgg ctacaacgtc aaagagttga tggatttctt tgcggatatt 240

ctaaatgata cctccatcac caatgttatg cttgtaggtg ttgggaatat ggggcgggcc 300

ttactacact atcgcttcca cgaacgaaat aaaatgaaaa tagtcatggc ttttgaagca 360

gatgataatc cagctgttgg aacgacagat gaaaatatcc caatccatgc aatctcagaa 420

atcaaggaac gtatcagcga agcaaactct cagaccgcca ttctaacggt acccagcgtc 480

aaggcacaag aagtgaccga tattcttgtt gaagctggtg tcaagggaat tctgagcttt 540

tcaccagtta acttgtctgt cccaaaagat gtcgttgttc agtatgttga tttgactagt 600

gaattacaga cactactcta ctttatgcga aaaggataa 639

<210> 2

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<212> DNA

<213> pSET3质粒

<400> 2

taattcgatg ggttccgagg ctcaacgtca ataaagcaat tggaataaag aagcgaaaaa 60

ggagaagtcg gttcagaaaa agaaggatat ggatctggag ctgtaatata aaaaccttct 120

tcaactaacg gggcaggtta gtgacattag aaaaccgact gtaaaaagta cagtcggcat 180

tatctcatat tataaaagcc agtcattagg cctatctgac aattcctgaa tagagttcat 240

aaacaatcct gcatgataac catcacaaac agaatgatgt acctgtaaag atagcggtaa 300

atatattgaa ttacctttat taatgaattt tcctgctgta ataatgggta gaaggtaatt 360

actattatta ttgatattta agttaaaccc agtaaatgaa gtccatggaa taatagaaag 420

agaaaaagca ttttcaggta taggtgtttt gggaaacaat ttccccgaac cattatattt 480

ctctacatca gaaaggtata aatcataaaa ctctttgaag tcattcttta caggagtcca 540

aataccagag aatgttttag atacaccatc aaaaattgta taaagtggct ctaacttatc 600

ccaataacct aactctccgt cgctattgta accagttcta aaagctgtat ttgagtttat 660

cacccttgtc actaagaaaa taaatgcagg gtaaaattta tatccttctt gttttatgtt 720

tcggtataaa acactaatat caatttctgt ggttatacta aaagtcgttt gttggttcaa 780

ataatgatta aatatctctt ttctcttcca attgtctaaa tcaattttat taaagttcat 840

ttgatatgcc tcctaaattt ttatctaaag tgaatttagg aggcttactt gtctgctttc 900

ttcattagaa tcaatccttt tttaaaagtc aatattactg taacataaat atatatttta 960

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aaatcaaaca aattttcatc aagctctagt gttttc 1056

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<213> artificial

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ggatccgaaa acactagagc ttgatg 26

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