基于p60蛋白的产单核细胞李斯特菌间接竞争ELISA的研究

摘要

产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）能引起人类和多种动物的感染。孕妇、新生儿、免疫功能低下者都是 LM易感人群。LM的主要临床症状是流产、败血症和脑膜炎。在同类食源性病原体中，LM是到目前为止毒力最强的食源性致病菌之一，致死率达20％-30%。
　　LM的致病机制复杂，包括多种毒力因子。其中由iap（invasion associated protein)基因编码的 p60蛋白与侵染性相关，是 LM的特异性毒力因子，因其分子量为60 KDa，所以简称为p60蛋白。该蛋白的发现为LM的特异性诊断与检测提供了可能。
　　本实验室前期成功构建了可以分泌p60蛋白的基因工程菌。在此基础上，本研究首先采用镍离子亲和层析方法制备得到了重组的p60蛋白，并制备得到了其多克隆抗体，然后建立了基于 p60蛋白的 LM的间接竞争酶联免疫吸附方法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）。主要内容和结果如下。1重组p60蛋白的镍离子亲和层析纯化
　　本研究首先采用菌落PCR、NdeI与XhoI双酶切和SDS-PAGE电泳对实验室前期构建的基因工程菌Escherichia coli BL21(DE3)进行了验证。结果表明，p60蛋白基因成功导入BL21菌株中，并且可以产生融合p60蛋白。
　　在此基础上，对Ni-NTA纯化重组p60蛋白的条件进行了优化，结果表明，以40 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱杂蛋白，再用250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白为最佳梯度洗脱条件。在此最佳条件下制备了浓度为1.53 mg/mL的 p60蛋白溶液20 mL，该方法蛋白的提取率为62.8%，纯度达到94.3%，为抗体的制备准备了材料。2抗p60蛋白多克隆抗体的制备
　　以上述纯化得到的重组p60蛋白为免疫原，以BALB/c小鼠为实验动物，分别以25、50和100μg/次/只3种免疫剂量，按14 d的免疫间隔期免疫小鼠，3次免疫后，3种免疫剂量均能有效刺激小鼠机体产生抗体，50μg/次/只的免疫剂量抗血清的效价最高，灵敏度最好，分别最高达到1:64000和9 ng/mL。
　　为了制备大量的多克隆抗体，在50μg/次/只免疫剂量，第4次免疫后，通过腹腔注射每只小鼠106个骨髓瘤细胞刺激4只小鼠产生腹水抗体。收集腹水，共得到10 mL腹水抗体，以间接ELISA测得其效价为1:8000-1:64000。
　　3基于p60蛋白的LM间接竞争ELISA的研究
　　以上述获得的p60蛋白及其小鼠腹水抗体为材料，对间接竞争 ELISA的条件进行了优化研究。研究表明：最佳包被液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline, PBS），最佳包被时间为37℃下包被1 h，最佳封闭剂为5%脱脂奶粉，最佳封闭时间是37℃封闭1 h，最佳的酶标二抗使用浓度为2000倍稀释。在此基础上，以竞争抑制率为纵坐标（Y,%），LM菌体浓度对数(lgC, CFU/mL)为横坐标（X），得到线性回归方程为：y=-12.5x+75.1，相关系数为0.9952，对LM的最低检测浓度为105 CFU/mL。
　　通过与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）、志贺氏菌(Shigella spp.）、酵母菌(Yeasts）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等微生物进行竞争实验，结果表明，本实验建立的ELISA对LM具有很好的特异性，适合于LM的快速检测。

目录

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缩略语表

第一章 文献综述

1 LM简介

1.1 LM的发现

1.2 LM的分类

1.3 LM的致病性

1.4 LM的流行情况

2 LM的致病机理和其毒力因子

2.1 LM的致病机理

2.2 LM侵染毒力因子

3 LM检测方法

3.1 传统的分离培养与鉴定方法

3.2 显色培养基快速鉴定技术

3.3 自动微生物鉴定分析系统

3.4 分子生物学检测方法

3.5 抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法

4 研究的目的和意义

第二章 LM重组p60蛋白的纯化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 iap基因的扩增

2.2 重组表达质粒的酶切验证

2.3 重组蛋白的诱导表达

2.4重组蛋白的亲和层析咪唑浓度的选择

2.5重组蛋白最佳浓度洗脱条件下结果分析

3 小结与讨论

3.1小结

3.2 讨论

第三章 LM重组p60蛋白多克隆抗体的制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果和分析

2.1 抗血清产生进程

2.2 间接非竞争ELISA法测定抗血清的效价

2.3 抗重组p60蛋白灵敏度分析

3.4 腹水抗体效价分析

3 小结与讨论

3.1 小结

3.2 讨论

第四章 基于p60蛋白的产单核细胞李斯特菌间接竞争ELISA 的研究

1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 最佳包被液的选择

2.2 包被时间的优化

2.3 最佳封闭液的选择

2.4 封闭时间的选择

2.5 二抗最佳稀释倍数的选择

2.6 标准曲线的绘制

2.7 抗血清特异性分析

3 小结与讨论

3.1 小结

3.2 讨论

第五章 总结与展望

1 总结

1.1 重组p60蛋白的纯化

1.2 重组p60蛋白多克隆抗体的制备

1.3 基于p60蛋白的产单核细胞间接竞争ELISA的研究

2 展望

2.1 对包涵体变性复性条件进行优化

2.2 纯化后的重组p60进行结构、功能分析及生物活性鉴定

2.3 制备重组p60蛋白单克隆抗体

参考文献

致谢