基因组改组选育高产β-半乳糖苷酶菌株

摘要

β-半乳糖苷酶常简称为乳糖酶，在食品、药品、保健品行业的应用潜力很大。关于乳糖酶酶活提高，目前国内外研究主要从以下几个方面着手：
　　 1，从工业发酵方面，主要是培养基优化，诱导因子的添加以及发酵模式，条件和提取工艺的优化，分离提纯等；
　　 2，筛选高产菌株，诱变育种；
　　 3，酶的改性技术；
　　 4，寻找比较高效表达系统；目前常用原核表达系统和真核表达系统，如Torres等将枯草杆菌KL88的β-半乳糖普酶基因片段克隆至大肠杆菌系统得到的β-半乳糖苷酶的产量比天然β-半乳糖苷酶高25-143倍；
　　 5，基因工程菌技术，重组DNA技术，对乳糖酶基因在分子水平上进行改造，从而定向筛选目标蛋白，得到理想变异。常用的研究方法有易错PCR，DNA shuffling，定点诱变等等；如姜世民等利用异源DNA同源重组体外定向进化大肠杆菌的β-半乳糖苷酶。国内对乳糖酶的研究起步较晚，到20世纪80年代才开始对乳糖酶进行研究。
　　 到目前为止已报道出一些乳糖酶的产生菌株，包括霉菌，细菌，酵母菌以及某些动植物。国外近年来对乳糖酶分子生物学方面研究比较多，嗜酸乳杆菌NCFM菌株的基因组已经完成测序，为从基因工程方面提高乳糖酶的酶活打下基础。
　　 本课题选取基因重组的途径来提高目标酶活，首先以传统发酵条件优化嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶，然后进行DNA shuffling，定向筛选提高酶活。通过基因重组途径获得的酶活结果进行比较，分析野生型菌株的β-半乳糖苷酶酶活与突变体菌株所产生的目标酶活之间的区别，利用生物信息学方法进行氨基酸序列比对，比较分析酶活差异性。
　　 嗜酸乳杆菌发酵条件进行优化后的培养基配方和发酵条件为：牛肉膏10g/L、酪蛋白胨10g/L、醋酸钠7.5g/L、硫酸镁150mg/L、硫酸锰35mg/L、磷酸氢二钾3g/L、葡萄糖5g/L、接种量5%、碳酸钙10g/L、柠檬酸三胺2.35g/L、酵母粉6.22g/L、发酵温度36℃、发酵时间为24h、转速为低速50r/min。经实验验证，该营养条件下的酶活力最大可达到3.98U/L，是优化前菌株的2.9倍。
　　 以嗜酸乳杆菌CICC6075为出发菌株，经基因组改组筛选出了一株具有较高酶活的高产菌株，菌株编号为嗜酸乳杆菌L.acidophilus-F2-10。该菌株所产的乳糖酶以ONPG为底物进行反应，酶活较诱变前有明显提高，酶活达到了7.56U/L，提高了4.6倍。改组菌所产β-半乳糖苷酶以ONPG为底物的酶学性质为：最适温度45℃，最适pH值是pH7，在40℃-50℃和pH6.0-9.0范围内具有较好的稳定性。Mg2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Al3+对此酶有明显的激活作用，而Cu2+、Zn2+、Ca2+对酶有较强抑制作用，K+对酶几乎没有影响。
　　 实验通过生物信息学方法，依据生物数据库对改组菌L.acidophilus-F2-10菌株β-半乳糖苷酶基因进行了PCR克隆和测序，β-半乳糖苷酶基因lacLM全长2834个碱基，协同翻译编码两个亚基，分别为628个aa，316个aa。对照野生型菌株进行基因比对和氨基酸比对，基因突变位点有5处，lacL基因编码的大亚基氨基酸突变位点有4处突变，其中3处同义突变，以ATG编码的M氨基酸为第一位标数，除第512位氨基酸R→H突变，第72位氨基酸S→S突变，245位Q→Q突变，247位G→G突变都为同义突变。lacM基因编码的小亚基氨基酸突变位点有1处突变Y→H。整章实验分析了基因突变位点与氨基酸二级结构、保守结构域之间的关系，推测出了改组菌酶活提高可能与结构域中的“Tim-barrel”折叠类蛋白突变位点相关，即第512位氨基酸R→H突变。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

第一章 前言

1 课题研究背景

2 乳酸菌B－半乳糖苷酶的研究进展

2.1 乳酸菌β-半乳糖苷酶培养条件优化的研究进展

2.2 生物技术开发高产β-半乳糖苷酶的研究进展

2.3 生物信息学在蛋白质结构分析中的应用

2.4 乳酸菌β-半乳糖苷酶分离纯化的研究进展

2.5 本实验的研究目的和内容

第二章 嗜酸乳杆菌产B－半乳糖苷酶发酵条件的优化

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 试剂与培养基

1.3 培养基

1.4 实验仪器

1.5 试剂配制

1.6 实验方法

2 结果与分析

2.1 利用Plackett-Burman法对β-半乳糖苷酶活力影响显著的因素筛选

2.2 发酵条件优化响应面试验分析

2.3 结论

3 讨论

3.1 关于显著因子

3.2 关于优化方法

第三章 基因组改组选育耐酵母粉高产B.半乳糖苷酶菌株

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 培养基

1.4 实验仪器

1.5 实验试剂溶液的配置

1.6 实验方法

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线

2.2 诱变剂量的选择

2.3 菌株诱变筛选结果

2.4 原生质体制备条件的选择

2.5 基因组改组(genome shuffling)

2.6 基因组改组菌株的遗传稳定性

3 讨论

3.1 关于诱变技术

3.2 关于筛选方法

3.3 关于菌株本身

第四章 重组菌B－半乳糖苷酶基因突变分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 常用试剂配制

1.5 引物

1.6 方法

2 结果与分析

2.1 改组菌β-半乳糖苷酶基因的扩增

2.2 改组菌β-半乳糖苷酶基因序列测定

2.3 改组菌与标准菌比对分析

2.4 小结

3. 讨论

3.1 关于引物步移Primer Waliking

3.2 关于“Tim－barrel”折叠蛋白

第五章 重组菌B－半乳糖苷酶酶学性质分析

1 材料与方法

1.1 实验菌株

1.2 发酵培养基

1.3 实验试剂

1.4 实验仪器

1.5 实验方法

2 结果与分析

2.1 乳糖酶的分离纯化

2.2 酶学性质

3 本章小结

4 讨论

4.1 硫酸铵分级盐析

4.2 透析脱盐

4.3 温度对β-半乳糖苷酶的影响

结论

参考文献

致谢

附录Ⅰ重组菌基因测序结果

附录ⅡB－半乳糖苷酶基因序列比对结果

附录Ⅲ本研究主要试剂的配制

附录Ⅳ在读硕士期间发表文章