多酶型枯草芽胞杆菌的发酵工艺优化与应用研究

摘要

本研究旨在对枯草芽胞杆菌的发酵工艺进行优化，从而提高其发酵液的酶活。而后通过固态发酵的方法，将其应用到处理豆粕的步骤中，获得了良好的效果。该研究对降低我国饲料行业成本，弥补饲料原料短缺，促进相关畜牧行业发展有着重大的现实意义。
　　 本研究以筛选细菌的多酶活性为出发点，从实验室分离和保藏的一批芽胞杆菌中，通过功能筛选的方法分别鉴定了这些芽胞杆菌的不同酶活，选出了一株综合活性最高的枯草芽胞杆菌BME-92，在实验室水平对该芽胞杆菌进行研究，发现其能够分泌五种功能性酶，并且活性很高，这些酶包括蛋白酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，淀粉酶和纤维素酶。根据微生物发酵和培养的特点，设计出一个能够发酵枯草芽胞杆菌的发酵培养基配方(豆粕20g/L，麸皮20g/L，(NH4)2SO41g/L，CaCl26g/L,K2HPO40.3g/L,MnSO4·H2O0.2g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L)。应用Plackett-Burman设计和响应面分析法设计相结合的优化方法，对该培养基配方进行了优化，确定了该培养基中影响枯草芽胞杆菌BME-92发酵产酶的主要因子及其最佳配方:豆粕17.3g/L，CaCl24.4g/L，K2HPO40.228g/L。其他影响不大的配方维持原比例。
　　 发酵配方确定之后，采用单因素优化的方法对发酵条件进行了优化，确定了最佳发酵条件如下:发酵温度37℃，接种种龄12h，接种量2％，发酵时间48h。发酵培养基优化和发酵条件优化后发酵液的酶活普遍得到了提高，其中蛋白酶的活性从1184.1U/mL提高到1895.6U/mL，提高了60％。
　　 将优化后的发酵产物和豆粕混合，通过固态发酵的方式来处理豆粕。处理后的豆粕中营养物质得到了很大的提高，可吸收短肽含量从0.41％提高到5.61％，单糖含量从1.53％提高到6.07％。从实际水平验证了该优化模型的可靠性和该处理方法的可行性。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 枯草芽胞杆菌的应用现状

1．1．1 枯草芽胞杆菌在养殖中的应用

1．1．2 枯草芽胞杆菌在农业生物防治中的应用

1．2 豆粕简介

1．2．1 豆粕的营养

1．2．2 豆粕蛋白质的组成

1．2．3 豆粕氨基酸的组成

1．2．4 豆粕的抗营养因子

1．3 发酵过程及优化

1．3．1 影响芽胞杆菌发酵的因素

1．3．2 培养基对发酵的影响

1．3．3 发酵条件对发酵的影响

1．3．4 发酵优化办法

1．4 本课题研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 溶液

2．1．4 仪器设备

2．2 高活性多产酶型菌株的筛选

2．2．1 菌株的活化及培养

2．2．2 目的菌株筛选

2．3 目的菌株总DNF提取和16S rRNA基因鉴定

2．3．1 基因组DNA的提取

2．3．2 菌株16S rRNA基因鉴定

2．4 目的菌株生长曲线绘制

2．5 目的菌株的酶活分析

2．5．1 标准曲线绘制

2．5．2 蛋白酶活性分析

2．5．3 木聚糖酶活性分析

2．5．4 甘露聚糖酶活性分析

2．5．5 淀粉酶活性分析

2．5．6 纤维素酶活性分析

2．6 液态发酵条件

2．7 液态发酵优化

2．7．1 发酵培养基优化

2．7．2 发酵条件优化

2．8 固态发酵及产物品质分析

2．8．1 单糖含量的测定

2．8．2 肽含量的测定

2．8．3 脲酶活性的测定

2．8．4 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析蛋白降解

2．9 泥鳅饲养应用实验

3 结果与分析

3．1 多酶活菌株筛选结果

3．2 BME-92菌株总DNA提取

3．3 BME-92菌株16S rRNA基因鉴定

3．4 枯草芽胞杆菌BME-92基本形态和生长曲线绘制

3．5 枯草芽胞杆菌BME-92液态发酵优化

3．5．1 液态发酵培养基优化

3．5．2 液态发酵条件优化

3．6 优化后发酵液酶活分析

3．6．1 标准曲线

3．6．2 酶活分析

3．7 固态发酵及产物品质分析

3．7．1 单糖和肽含量的测定

3．7．2 抗营养因子含量的测定

3．7．2 大分子蛋白降解分析

3．8 泥鳅饲养应用实验

4 讨论

参考文献

研究成果

致谢