人工合成甘蓝型油菜类黄酮合成途径基因序列和表达变化研究

摘要

多倍化在植物进化和物种形成过程中起着举足轻重的作用，对多倍体的基因组进化和基因表达的研究已成为近年来植物界的研究热点之一。人工合成的芸薹属异源多倍体由于亲本来源明确，已经成为研究多倍体进化过程中遗传和表观遗传变化的模式植物之一。甘蓝型油菜黄籽育种是油菜高含油量育种的一个重点工作，但是众多研究表明，黄籽的遗传非常复杂，除受环境影响外，不同遗传背景的材料控制黄籽性状的基因也不同。本研究以6个黄/黑籽甘蓝型油菜人工合成种(AACC，2n=38)不同世代群体和亲本白菜型油菜（代号1151、JB2、DB，基因组AA，2n=20）、甘蓝（代号T1、T2、T3、03K04，基因组CC，2n=18）为材料，利用序列特异性扩增和Real-Time PCR等方法，分析类黄酮生物合成过程中的部分关键基因在甘蓝型油菜多倍体进化过程中的基因组成及表达变化，期望为揭示甘蓝型油菜黄籽形成的分子基础和芸薹属多倍体进化过程提供有利的信息。本研究主要结果如下:
　　 1.序列消除的偏向性。根据类黄酮生物合成途径中的15个关键基因的保守序列设计了47对特异引物，在各人工合成种的不同世代进行序列特异性扩增，结果表明，以白菜型油菜为母本的组合1151× T2、1151×03K04、JB2×T3中所有多倍体后代丢失了更多来自A基因组的特异基因片段。以甘蓝为母本的T1×DB组合，后代同样丢失了更多来自A基因组的片段，03K04×DB丢失A、C基因组片段比例相当， T1×JB2却丢失更多来自C基因组的片段。
　　 2.序列消除的趋向稳定性。组合1151×T2(S1-S6、S8)合成种后代中，S1代丢失来自A、C基因组的比例最高，随着世代递增，丢失A、C基因组比例有所降低并逐渐趋于平稳。伴随着基因片段的丢失，也出现了一些新增带，占总扩增带的12.1％。
　　 3.各基因在各组合序列变化的规律性。所有组合的人工合成种都严格保留了来自于C基因组中的TT2基因片段，1151×T2、1151×03K04、T1×DB、T1×JB2组合的TT12丢失更多来自A基因组片段。组合T1×JB2、1151×03K04的人工合成种中丢失的来自A、C基因组的TT8片段比例相当，而其它4个组合的合成种表现为丢失更多来自A基因组的TT8基因序列。组合1151×03K04的合成种几乎保留了全部来自双亲的TT16基因片段，而其它5个组合的合成种丢失较多来
　　 4.自C基因组的TT16基因片段。TT18特异引物在1151× T2(S1-S6、S8)的合成种中扩增出较多新增带，而在1151×03K04、T1×JB2组合中出现少量新增带，在T1×DB、JB2×T3、03K04×DB组合中无新增片段出现。
　　 5.对TT6、 TT10、TT12、TT18这4个基因在6个组合各世代株系中的新增片段（113条）测序，TT18中有长为200-300bp的片段在该基因内含子处插入或丢失，比对发现该插入片段为DNA转座子(TcMar-Stowaway)片段。TT6、TT10、TT12新增片段的序列与亲本扩增片段相比只在内含子处有少量碱基的插入、丢失，或在外显子有个别碱基变化。
　　 6.以1151×T2组合亲本及S8代3个黄、黑籽株系的10、20、30天种皮为材料，采用RT-PCR的方法研究类黄酮合成途径中7个关键基因(TT3、TT6、TT8、TT10、TT12、TT18、TT19)在合成种中的表达情况，发现在黑籽株系与甘蓝T2中，TT6、TT8、TT18基因均表现为随时间变化上调表达，而在黄籽株系与白菜型油菜1151中，TT6、TT8、TT12表现为随时间变化表达量先增加，在授粉后20天达到相对表达量最高值，后期表达量又逐渐降低。双亲与所有后代的TT10表达趋势均一致，均为上调。双亲与后代TT19表达趋势也一致，在20天达到表达量高峰值，随后降低。还发现，合成种黑籽株系的6个基因(TT3、TT6、TT8、TT12、TT18、TT19)的相对表达量高于黄籽株系，其相对表达量是黄籽株系的4～30倍。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 异源多倍体基因组组成变化

1．1．1 序列消除

1．1．2 染色体重排

1．2 异源多倍体基因组表达水平变化

1．2．1 异源多倍体基因组表达变化

1．2．2 异源多倍体基因组表观遗传变化

1．3 种皮色素合成相关基因研究进展

1．3．1 拟南芥类黄酮合成途径及基因克隆

1．3．2 油菜类黄酮合成相关基因研究

1．4 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 序列特异扩增材料

2．1．2 Real-Time PCR材料

2．2 试验方法

2．2．1 DNA的提取

2．2．2 甘蓝型油菜类黄酮途径关键基因的获得和引物设计

2．2．3 序列特异性扩增

2．2．4 新增片段的克隆与测序

2．2．5 总RNA的提取及质量检测

2．2．6 qRT-PCR引物设计

2．2．7 Real-time PCR

3 结果与分析

3．1 类黄酮合成途径关键基因在甘蓝型油菜人工合成种中的扩增

3．2 类黄酮合成途径关键基因在组合1151×T2合成种中DNA序列变化

3．3 类黄酮合成途径关键基因在其他组合合成种中DNA水平变化

3．4 各类黄酮合成途径关键基因在甘蓝型油菜合成种中DNA水平变化

3．5 新增片段序列分析

3．6 类黄酮合成途径关键基因的表达变化

3．6．1 总RNA检测结果

3．6．2 类黄酮合成途径关键基因的表达趋势及相对表达量

4 讨论

4．1 类黄酮合成途径关键基因DNA水平变化分析

4．2 类黄酮合成关键基因的表达变化分析

4．3 1151×T2组合不同颜色种皮合成种类黄酮合成途径关键基因的构成及表达分析

参考文献

附录

致谢