黄颡鱼神经肽Y和生长抑素基因克隆、表达及与生长性状相关性研究

摘要

调控鱼类生长的核心主要由垂体分泌的生长激素-肝脏内分泌类的胰岛素生长因子(Ⅰ)组成的神经内分泌生长轴(GH-IGF-(Ⅰ))调节，GH-IGF-(Ⅰ)内分泌轴的作用开始于垂体中GH的产生，而神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)和生长抑素(Somatostatin)是GH两种主要的调控因子，NPY在鱼类体内调控鱼类的摄食，诱导GH的释放，Somatostatin则抑制GH的释放。
　　 黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲇形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus Bleeker)，是我国重要的淡水名优养殖品种，黄颡鱼新品种选育工作已开展多年，现阶段生长速度快是黄颡鱼选育的主要目标，通过分子标记辅助育种能够加快黄颡鱼的选育进程。NPY和Somatostatin基因作为能够调控生长激素释放的因子，通过对黄颡鱼NPY和Somatostatin基因的克隆，研究其在黄颡鱼各个组织中的表达、胚胎发育阶段的表达、仔鱼时期发育的表达，为阐明鱼类的神经内分泌生长轴提供理论依据，并将NPY基因作为与生长相关的候选功能基因筛选多态位点，对NPY的多态性与生长相关性进行分析，为黄颡鱼分子标记辅助育种奠定应用基础。本研究的主要实验结果如下:
　　 1.黄颡鱼神经肽Y(NPY)基因cDNA全序列的克隆及其表达特征分析
　　 黄颡鱼NPY基因cDNA序列全长772 bp，开放阅读框282 bp，编码93个氨基酸，其与瓦氏黄颡鱼同源性最高(97％)，与斑点叉尾鮰、建鲤、胭脂鱼、中华倒刺鲃的同源性分别为87％，72％，72％和70％。NPY mRNA在胚孔闭合期开始检测到表达，到出膜期是一个表达升高的过程;黄颡鱼出膜第一天到第二十天都能检测到NPYmRNA的表达，在黄颡鱼出膜第三天到第五天NPY mRNA表达量显著高于出膜第一天(P＜0.05）;黄颡鱼NPY基因在黄颡鱼成体组织脑、脾脏、肝脏、鳃、性腺中都有表达，而在心脏、肌肉、胃、肾脏中不表达，在脑中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01）;随着饥饿时间的增加黄颡鱼脑组织中NPY表达量升高，重新投饵后NPY表达含量下降到正常水平。
　　 2.黄颡鱼生长抑素(Somatostatin)基因cDNA全序列克隆及其表达特征分析
　　 黄颡鱼生长抑素cDNA全长694bp，其中5'端非翻译区139bp，3'端非翻译区211bp，开放阅读框为345bp，编码114个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明，黄颡鱼生长抑素基因与其它鱼类生长抑素基因同源性较高。实时荧光定量PCR检测了生长抑素基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育及成鱼各个组织的表达特征，生长抑素基因在受精卵时期就有表达，并持续至胚胎孵化，心跳期、出膜期其表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);自出膜后的1-20d里，生长抑素基因在黄颡鱼中一直保持稳定的表达;在成体阶段Somatostatin基因只在脑组织中特异性表达。
　　 3.黄颡鱼NPY基因多态性与生长性状相关性研究
　　 利用PCR-SSCP技术对黄颡鱼NPY基因的cDNA序列进行了多态位点的查找，在N3引物的SSCP结果中呈现多态性，测序发现一个A→C的突变位点(616bp)，结果表现出3种基因型，命名为AA、AB、BB基因型，通过不同基因型与黄颡鱼生长性状相关性的分析，在6月龄雄性群体间和整个群体间AA基因型体重显著大于AB基因型和BB基因型体重(P＜0.05);12月龄的黄颡鱼雄性群体间、雌性群体间和整个群体间AA基因型体重显著大于AB基因型和BB基因型体重(P＜0.05)。在雄性群体间和整个群体间AA基因型的体长显著大于AB基因型和BB基因型体长(P＜0.05);在12月龄极小群体和整个群体中，AA基因型体重显著高于AB基因型和BB基因型(P＜0.05)。由此可见AA基因型是黄颡鱼的生长的优势基因型，在黄颡鱼选育中，可以增加AA基因型个体。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 黄颡鱼的生物学特征和资源现状简介

2 鱼类生长轴相关基因研究

2．1 GH

2．2 IGFS

2．3 GHRH和PACAP

2．4 GnRH

2．5 Ghrelin和CCK

2．6 TRH、CRF和DA

2．7 Leptin和NE

2．8 NPY

2．9 Somatostatin

3 本研究的目的和意义

第二章 黄颡鱼NPY基因的克隆及其表达特征分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 黄颡鱼NPY基因cDNA全长克隆

2．2 黄颡鱼NPY cDNA序列分析

2．3 NPY蛋白的生物信息学分析

2．4 基于NPY氨基酸序列的同源性分析

2．5 黄颡鱼NPY基因表达特征分析

3 讨论

3．1 黄颡鱼NPY基因的保守性

3．2 黄颡鱼NPY基因表达特征分析

第三章 黄颡鱼生长抑素基因的克隆及其表达特征分析

1 材料与方法

2 结果与分析

2．1 黄颡鱼Somatostatin基因cDNA全长克隆

2．2 黄颡鱼Somatostatin cDNA序列分析

2．3 Somatostatin蛋白的生物信息学分析

2．4 基于Somatostatin氨基酸序列的同源性分析

2．5 黄颡鱼Somatostatin基因表达特征分析

3 讨论

第四章 黄颡鱼NPY基因多态性与生长性状相关性研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 NPY基因的多态性检测

2．2 多态片段序列分析

2．3 NPY基因的遗传多样性分析

2．4 NPY基因多态性与生长性状相关性分析

3 讨论

参考文献

致谢

附录Ⅰ