广泛调控子Ms6564的晶体结构及其与DNA相互作用的分子机制研究

摘要

蛋白质-DNA相互作用在众多生物学过程中都发挥着重要的作用，对于转录调控而言，蛋白质与DNA的互作则显得尤为重要，这是因为只有当转录因子精确结合目标DNA时调控才能正确起始。
　　近些年来，能够广泛调控大量基因表达的关键转录因子被认为对于细菌的生长以及环境的适应性至关重要，然而，这类关键转录因子结合目标DNA的机制却并不清楚。新鉴定的耻垢分枝杆菌关键转录调控因子Ms6564能够广泛并特异性的调控339个目标基因的表达，对该转录因子DNA结合机制的研究将有助于我们深入理解蛋白质与DNA的相互作用。
　　本研究通过X射线晶体学方法解析Ms6564与operator复合物的三维结构，从而从分子水平上理解Ms6564的DNA结合机制。首先，我们设计了不同的Ms6564截短蛋白并选取最稳定的截短体用于晶体的生长，通过结晶条件的筛选及优化我们获得了Ms6564天然蛋白以及硒代甲硫氨酸蛋白(SeMet-Ms6564)两种晶体并解析出了Ms6564的三维结构。晶体结构显示出Ms6564具有典型的TetR家族蛋白特征，但是与其它TetR家族蛋白相比，其较短的α4螺旋使得该蛋白在结构上具有更大的柔软性，而DNA结合结构域(DBD)与配体结合结构域(LBD)相对位置较大的可变性使得Ms6564对目标DNA的选择更加宽泛。
　　接着，通过结晶条件的筛选及优化我们获得了Ms6564-DNA、SeMet-Ms6564-DNA以及溴标DNA-Ms6564这三种复合物的晶体，并以此为基础成功解析了Ms6564-DNA的三维结构。晶体结构表明Ms6564以两个二聚体的方式结合目标DNA且两个二聚体的对称轴落在同一平面上。目标DNA在与Ms6564结合后发生了较小的形变及解旋，这意味着Ms6564结合DNA所需的能量较低。通过观察Ms6564与DNA相互作用的界面，我们发现Ms6564的识别螺旋α3只是浅浅的插入DNA大沟内，这种松散的蛋白-DNA结合方式暗示着蛋白更容易在DNA上滑动。令人意外的是，11个不规则的水分子掺入到了Ms6564-DNA相互作用界面内并介导了蛋白与DNA的互作。在Ms6564的DBD内，只有Lys47和Gln48这两个氨基酸残基特异性地与DNA碱基互作，其中Lys47对于特异性的DNA识别更加重要。
　　我们的研究表明Ms6564能松散地与DNA结合且保持了对DNA较高的亲和力与特异性，这暗示着该蛋白能够在耻垢分枝杆菌基因组上较为轻松的滑动并特异性的结合众多目标DNA。Ms6564这种集广泛性与特异性于一身的DNA结合方式是其能够调控大量基因表达的关键，而Ms6564-DNA复合物晶体结构的解析也使我们对蛋白质与DNA相互作用的机制有了进一步认识。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 蛋白-DNA识别机制

1．1．1 Base Readout机制

1．1．2 Shape Readout机制

1．2 转录调控因子的结构特征

1．2．1 Mainly α转录调控因子

1．2．2 Mainly β转录调控因子

1．2．3 Mixed α／β转录调控因子

1．3 TetR家族转录调控因子

1．3．1 TFRs保守的结构特征

1．3．2 TFRs的配体结合空腔

1．4 TFR与DNA相互作用的研究进展及存在的问题

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验所用菌株

2．1．2 实验所用质粒

2．1．3 PCR引物

2．1．4 实验所用酶和试剂(盒)

2．1．5 抗生素与培养基

2．1．6 缓冲液与试剂的配制

2．1．7 实验所用仪器

2．2 实验方法

2．2．1 目标基因的克隆

2．2．2 大肠杆菌化学感受态的制备及转化

2．2．3 组氨酸标签融合蛋白的表达纯化

2．2．4 胰蛋白酶水解实验

2．2．5 TEV酶的表达与纯化

2．2．6 SDS-PAGE凝胶的制备及电泳

2．2．7 蛋白晶体的生长与优化

2．2．8 蛋白晶体结构的解析

2．2．9 凝胶阻滞电泳EMSA

3 结果与分析

3．1 Ms6564基因的克隆

3．2 Ms6564蛋白的纯化

3．3 Ms6564蛋白晶体的生长

3．3．1 Ms6564天然蛋白晶体的生长

3．3．2 Ms6564硒代蛋白晶体的生长

3．4 Ms6564-DNA复合物的组装

3．5 Ms6564-DNA复合物晶体的生长

3．5．1 Ms6564-DNA复合物晶体的生长

3．5．2 硒代Ms6564-DNA复合物晶体的生长

3．5．3 溴标DNA-Ms6564复合物晶体的生长

3．6 Ms6564结构的解析

3．6．1 Ms6564硒代蛋白晶体衍射数据的处理

3．6．2 寻找Ms6564硒代蛋白中的重原子

3．6．3 Ms6564电子密度图的生成

3．7 Ms6564-DNA复合物结构的解析

3．7．1 硒代Ms6564-DNA复合物晶体衍射数据的处理

3．7．2 寻找硒代Ms6564-DNA复合物中的重原子

3．7．3 Ms6564-DNA复合物电子密度图的生成

3．7．4 DNA碱基序列的确定

3．8 Ms6564结构的分析

3．8．1 Ms6564结构的概述

3．8．2 Ms6564同源二聚体相互作用界面

3．8．3 Ms6564与其它TetR家族蛋白的比较

3．9 Ms6564-DNA复合物结构的分析

3．9．1 Ms6564-DNA复合物结构的概述

3．9．2 Ms6564-DNA复合物中DNA的形变

3．9．3 水分子介导的Ms6564与DNA间接的相互作用

3．9．4 Ms6564与DNA直接的相互作用

4 总结与讨论

4．1 总结

4．2 讨论

4．2．1 Ms6564 N端手臂的功能

4．2．2 Ms6564 DNA结合形式的多样性

4．2．3 Ms6564的DNA识别螺旋

4．2．4 水分子介导的间接相互作用

4．2．5 Ms6564结合DNA的特异性

4．2．6 Ms6564的变构调控机制

参考文献

论文发表情况

致谢