鸡蛋贮藏期间三种蛋白质结构与功能性质的变化研究

摘要

本文以鸡蛋蛋清中的卵白蛋白(ovalbumin)、溶菌酶(lysozyme)以及卵粘蛋白(ovomucin)为研究对象，以三种蛋白质的结构与功能为核心，在制备出高纯度和高活性蛋白质的基础上，研究了三种蛋白质在贮藏期间结构与功能性质的变化情况，对三种蛋白质的结构变化与全蛋清功能活性之间的相关性进行了初步探究。主要研究内容和结果如下:
　　首先，对ovalbumin在贮藏期间的结构变化情况进行了检测。结果显示在贮藏期间ovalbumin内源荧光强度由125上升至330，推测这种现象主要是由于分子间聚集情况的发生而导致的。圆二色谱中0d的ovalbumin含有大量的α-螺旋和β-折叠结构，是属于高度有序的α+β型蛋白质，其中β-折叠含量最高，占35.3％。Ovalbumin在贮藏期间其结构的有序性下降，无序性上升，无规卷曲结构在贮藏第0d与第50d分别为20.6％与27.5％，红外光谱中显示贮藏0d的ovalbumin的无规卷曲结构含量占20.14％，而贮藏第50d无规卷曲含量上升至24.02％;ovalbumin的Trp拉曼强度由0d的0.45下降至50d的0.14;PHe强度由0.78下降至0.42;505cm-1处的二硫键强度由0.43下降至0.18;在整个贮藏期间Tyr的下降幅度最小，仅下降0.02个单位值。二硫键谱峰强度的下降说明ovalbumin的分子内二硫键发生了断裂，ovalbumin的分子结构变的松散。
　　其次，对lysozyme在贮藏期间的结构变化情况进行了检测。Lysozyme的荧光强度在贮藏期间由52上升至723，这说明，lysozyme的三种发色氨基酸(Trp、Tyr以及PHe)的微环境极性在不断下降，推测主要是由于在贮藏期间Trp残基不断包埋于分子内部而导致的。圆二色谱结果显示贮藏0d的lysozyme也含有大量的α-螺旋和β-折叠结构，其中，α-螺旋含量最高，占34.72％。无规卷曲结构由贮藏0d的24.25％上升至贮藏50d的36.52％，说明分子无序度在不断上升。红外谱图中无规卷曲含量第0d与第50d分别为27.62％和37.27％。拉曼结果显示，lysozyme含有4对二硫键，贮藏期间可以观察到二硫键谱峰由520cm-1处逐渐向507cm-1方向移动，这说明链接lysozyme两个结构域的二硫键首先发生了断裂，其次才是lysozyme分子内部的二硫键发生断裂。
　　第三，采用多种检测方法对ovomucin贮藏期间的结构变化进行了分析。贮藏期间ovomucin的内源荧光强度由365下降至176。表明在贮藏期间，ovomucin不断变性降解，聚合成程度降低，分子间碰撞程度增加。Ovomucin本身为聚合型分子，在贮藏期间其分子聚合度在下降，分子无序性上升，无规卷曲由26.6％上升至35.8％。Ovomucin的红外光谱结果显示ovomucin的无规卷曲含量在贮藏期间有所下降，表现为1660-1640cm-1处的谱峰面积由0d的28.36％下降至50d的26.34％。这跟其自身聚合程度在不断下降有关。与红外光谱相比，溶液状态下的ovomucin在某种程度上更能代表ovomucin在贮藏期间的改变。
　　第四，利用ovomucin与其抗体的特异性结合，采用间接ELISA方法建立了一种快速高效的ovomucin含量检测方法。该方法用于卵粘蛋白的免疫分析，标准曲线的浓度范围是50ng/mL-1000ng/mL;抗体与鸡蛋蛋清内的其他主要杂蛋白（卵白蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶等）间交叉反应率均小于0.01％，说明该方法不仅灵敏度高而且特异性强，可应用于检测禽蛋蛋清内ovomucin的含量。
　　最后，本实验对贮藏期间三种蛋白质及蛋清的乳化活性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性以及lysozyme和蛋清的溶壁活性、ovomucin和蛋清的凝胶特性进行了测定，并对其进行了双变量相关性分析。分析结果显示，蛋清的乳化活力与ovalbumin的β-折叠和ovomucin的无规卷曲结构呈极显著性相关，显著性差异P＜0.01，相关系数分别为-0.936与0.919;蛋清乳化稳定性主要受lysozyme的α-螺旋和无规卷曲影响，相关系数为0.859和0.908，显著性差异P＜0.05，属显著性相关;蛋清起泡能力主要与ovalbumin的β-转角有关，相关系数0.914，显著性差异P＜0.05;泡沫稳定性主要与lysozyme的有序结构（α-螺旋、β-折叠和β-转角）有关，其中与β-转角为极显著性相关，显著性差异P＜0.01，与α-螺旋与β-折叠为显著性相关，P＜0.05;溶壁活性与凝胶特性分别与lysozyme的β-折叠和ovomucin的无规卷曲高度相关，显著性差异均小于0.01。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 鸡蛋贮藏期间蛋清稀化及其对鸡蛋品质的影响

2 Ovalbumin分子结构与功能特性研究进展

2．1 Ovalbumin的分子结构及研究进展

2．2 Ovalbumin的功能特性与研究进展

3 Lysozyme分子结构与功能特性的研究进展

3．1 Lysozyme的分子结构及其研究进展

3．2 Lysozyme的功能特性及研究进展

4 Ovomucin分子结构与功能性质的研究进展

4．1 Ovomucin的分子结构及研究进展

4．2 Ovomucin的功能特性及研究进展

5 蛋白质分子结构的测定方法

5．1 X-射线衍射法(XRD)

5．2 傅里叶红外光谱法(FT-IR)

5．3 核磁共振光谱法(NMR)

5．4 圆二色谱法(CD)

5．5 荧光光谱法(FI)

5．6 拉曼光谱法(Raman)

6 本课题研究的目的和主要研究内容

6．1 研究目的与意义

6．2 学术思路

6．3 主要研究内容

第二章 鸡蛋贮藏期间ovalbumin结构变化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 贮藏时间的确定

2．2 Ovalbumin提取纯度的鉴定

2．3 贮藏期间ovalbumin荧光光谱变化

2．4 贮藏期间ovalbumin圆二谱图变化

2．5 贮藏期间ovalbumin红外谱图变化

2．6 贮藏期间ovalbumin的拉曼光谱表征

3 讨论

4 小结

第三章 鸡蛋贮藏期间lysozyme结构变化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 Lysozyme纯度鉴定

2．2 贮藏期间lysozyme荧光光谱表征

2．3 贮藏期间lysozyme圆二色谱变化

2．4 贮藏期间lysozyme红外光谱变化

2．5 贮藏期间lysozyme拉曼光谱变化

3 讨论

4 小结

第四章 鸡蛋贮藏期间ovomucin结构变化的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 ovomucin纯度鉴定

2．2 贮藏期间ovomucin荧光光谱表征

2．3 贮藏期间ovomucin圆二色谱变化

2．4 贮藏期间ovomucin红外光谱变化

3 讨论

4 小结

第五章 鸡蛋ovomucin含量的ELISA测定方法建立

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 Ovomucin的纯化

2．2 方阵实验结果

2．3 抗体效价检测结果

2．4 优化反应条件结果

2．5 ELISA标准曲线

2．6 特异性检测结果

2．7 稳定性及回收率检测结果

3 讨论

4 小结

第六章 贮藏期间三种蛋白质结构变化与功能性质的变化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 贮藏期间三种蛋白质的含量变化

2．2 贮藏期间蛋清及三种蛋白质乳化性能的测定

2．3 贮藏期间蛋清及三种蛋白质起泡性质的测定

2．4 贮藏期间蛋清及lysozyme溶壁活性变化规律

2．5 贮藏期间蛋清及ovomucin凝胶特性的变化情况

2．6 相关性分析

3 讨论

4 小结

第七章 结论与展望

1 结论

2 创新性

3 本研究存在的问题与展望

参考文献

致谢

附录 研究生期间科研情况