耐冷及嗜盐木聚糖酶的基因克隆、表达、酶学性质及突变研究

摘要

半纤维素是除了纤维素以外最为丰富的多糖，也是自然界中的第二大可再生资源，所以人们对它的主要组成成分木聚糖的降解有着广泛的兴趣。降解木聚糖的最主要的糖苷水解酶是内切-β-1，4-木聚糖酶，它可以降解木聚糖主链的β-1，4-糖苷键，产生低聚寡糖和木糖。木聚糖酶在工业上，如饲料、造纸、食品、能源、纺织等方面的应用都已经非常的广泛。为了满足不同的工业需求，发掘和研究具有不同嗜极性质（嗜碱、嗜酸、嗜冷、嗜盐、嗜热等等）的木聚糖酶显得尤为重要。
　　本研究从一株来自海洋沉积物中的深海王祖农菌Zunongwangia profunda中，利用特异性引物克隆了一木聚糖酶基因xynA，并成功的将其在大肠杆菌E.coli(DE3)中进行诱导表达，经纯化后进行了酶学性质的分析。同时针对该木聚糖酶的特点，利用随机突变技术进行了定向进化改造。所取得的研究进展如下:
　　1.利用PCR技术从Zunongwangia profunda克隆得到的内切-β-1，4-木聚糖酶基因xynA全长1125bp，共编码374个氨基酸，蛋白分子量大小是43.7kDa。XynA的等电点pI是6.632，GC含量是38.81％。经预测该木聚糖酶没有信号肽。通过BLAST比对，XynA属于糖苷水解酶第10家族，催化氨基酸残基是Glu169和Glu276。在已报道的木聚糖酶中，XynA最高相似性为42.78％。将XynA在大肠杆菌E.coli(DE3)中诱导表达，经纯化后分析木聚糖酶的酶学性质。XynA的最适pH是6.5，最适温度30℃，在0℃和5℃的低温仍分别可以保持15％和32％的活性。XynA不仅仅是一个冷活性的木聚糖酶，而且是一个耐盐的木聚糖酶。NaCl可以大大的提高酶的活性并增强酶的热稳定性。XynA的最适盐浓度是3.0mol/L NaCl，表现出最大激活活性191％，而且在5.0mol/L NaCl时，仍可以保持100％的活性。以1.0％山毛榉木聚糖为底物时，在有3.0mol/L NaCl存在时，XynA的Vmax、Km、kcat、kcat/Km分别由无NaCl存在时的0.05291mg/mL/min、2.98mg/mL、47.26/s、15.87mL/mg/s变成了0.03459mg/mL/min、1.15mg/mL、80.33/s、69.91mL/mg/s。在热稳定性方面，与没有NaCl存在时相比，3.0mol/L的NaCl使XynA在45℃孵育1h后的活性由8％提升到了55％，大大增强了木聚糖酶的热稳定性。这可能是第一个报道的在如此高浓度(3.0mol/L-5.0mol/L)的NaCl还可保持高活性的耐冷木聚糖酶。这一性质使得该木聚糖酶在食品以及从海藻中生产生物乙醇等方面具有潜在的应用价值。
　　2.针对木聚糖酶XynA高耐盐性这一特点，欲使其该特点更加的突出，利用易错PCR技术构建了随机突变库，并针对性的在筛选底物中添加3.5mol/L的NaCl。从约7000个突变体中成功的筛选到一株突变体XynA-JD27，氨基酸序列比较后发现，在其C末端比野生型的少了27个氨基酸。突变株的最适pH仍是6.5，与野生型的一样。但是最适温度降到了25℃，并且在5℃可以保持50％的活性，而在稍高的温度条件下的活性没有野生型的高。最适盐浓度提升到3.5mol/L NaCl，并且在1.0mol/L-5.0mol/L NaCl范围内都可保持148％以上的活性，较野生型的盐激活作用有了很大的提高。在以1％的山毛榉为底物时，XynA-JD27的Vmax、Km、kcat和kcat/Km分别是0.08288mg/mL/min、3.86mg/mL、69.92/s和18.11mL/mg/s。在加入3.5mol/L NaCl后，XynA-JD27的Vmax、Km、kcat和kcat/Km分别变成了0.0645mg/mL/min、1.51mg/mL、108.9/s和72.12mL/mg/s。这说明NaCl可以降低该突变木聚糖酶的反应速率，但是可以增强木聚糖酶与底物的亲和力，另外C末端对木聚糖酶的耐冷性和耐盐性都有一定的作用，这为该酶结构与功能研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 木聚糖

1．2 木聚糖酶

1．2．1 木聚糖水解酶系

1．2．2 木聚糖酶的分类

1．3 木聚糖酶的催化机制

1．4 木聚糖酶的酶学性质

1．4．1 木聚糖酶的最适作用pH值

1．4．2 木聚糖酶的最适反应温度

1．4．3 金属离子及化学试剂对木聚糖酶活性的影响

1．5 嗜极木聚糖酶

1．5．1 嗜碱／嗜酸木聚糖酶

1．5．2 嗜热木聚糖酶

1．5．3 嗜冷木聚糖酶

1．5．4 嗜盐木聚糖酶

1．6 嗜极木聚糖酶的应用

1．6．1 木聚糖酶在动物饲料中的应用

1．6．2 木聚糖酶在食品工业中的应用

1．6．3 在造纸技术中的应用

1．6．4 在能源方面的应用

1．6．5 在麻类纺织工业中的应用

1．7 本研究的目的和意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 溶液

2．1．5 仪器设备

2．2 细菌基因组DNA抽提

2．3 碱裂解法抽提细菌的质粒DNA

2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．5 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白

2．6 木聚糖酶基因xynA的克隆

2．6．1 木聚糖酶基因的扩增

2．6．2 木聚糖酶PCR产物回收及酶切

2．6．3 酶连以及电转化

2．6．4 阳性克隆子的筛选

2．7 木聚糖酶XynA的诱导、表达及纯化

2．7．1 重组质粒pGEX-6p-xynA转化

2．7．2 木聚糖酶xynA的诱导表达

2．7．3 木聚糖酶XynA的纯化

2．7．4 凝胶电泳和蛋白浓度的测定

2．8 木聚糖酶XynA的酶学性质研究

2．8．1 标准曲线的绘制

2．8．2 木聚糖酶活性的测定方法

2．8．3 木聚糖酶的最适pH和最适温度

2．8．4 木聚糖酶的pH稳定性和热稳定性

2．8．5 木聚糖酶的底物特异性

2．8．6 金属离子及化学试剂对酶活的影响

2．8．7 木聚糖酶的最适盐浓度及盐耐受性

2．8．8 NaCl对木聚糖酶热稳定性影响的测定

2．8．9 荧光光谱法测定NaCl对木聚糖酶热稳定性的影响

2．8．10 木聚糖酶的酶动力学测定

2．8．11 同源模建

2．9 木聚糖酶XynA的随机突变体库的构建

2．9．1 易错PCR扩增xynA

2．9．2 易错PCR产物的回收与酶切

2．9．3 酶连及转化

2．9．4 验证随机突变体库的突变频率

2．9．5 基于96孔板的高通量木聚糖酶突变文库筛选

2．9．6 突变株蛋白的诱导表达和纯化

2．9．7 突变菌株的基本酶学性质测定

2．9．8 突变型菌株的酶动力学常数

3 结果与分析

3．1 木聚糖酶基因xynA的克隆

3．2 木聚糖酶XynA的序列分析

3．3 木聚糖酶基因的表达及纯化

3．4 木聚糖酶XynA的酶学性质研究

3．4．1 木糖标准曲线的绘制

3．4．2 木聚糖酶XynA的最适pH和pH耐受

3．4．3 木聚糖酶XynA的最适温度和热稳定性

3．4．4 木聚糖酶的底物特异性

3．4．5 木聚糖酶的最适盐浓度及盐耐受性

3．4．6 NaCl对木聚糖酶热稳定性影响

3．4．7 金属离子及化学试剂对酶活的影响

3．4．8 荧光光谱学测定NaCl对木聚糖酶热稳定性的影响

3．4．9 木聚糖酶的酶动力学测定

3．4．10 木聚糖酶XynA的三维结构分析

3．5 xynA基因的随机突变库的构建

3．5．1 易错PCR法扩增木聚糖酶基因xynA

3．5．3 随机突变库突变频率检测

3．5．4 高活性木聚糖酶的筛选

3．6 突变株的酶学性质测定

3．6．1 突变株的最适pH和最适温度

3．6．2 突变株的最适盐浓度和盐耐受性

3．6．3 突变株酶动力学参数的测定

4 讨论

4．1 野生型木聚糖酶的分析

4．2 木聚糖酶随机突变分析

参考文献

附录

1．木聚糖酶的核苷酸

2．研究成果

致谢