一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用

摘要

本发明提供了一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用。通过提取该金属硫蛋白基因，设计引物TAC‑F7、TAC‑R5，经PCR扩增后与表达载体进行连接，构建重组质粒；将重组质粒转化入表达菌株，构建重组基因工程菌；建立了该重组蛋白的表达与纯化方法。该低温嗜盐α‑淀粉酶核苷酸序列及编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其信号肽的基因和氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该淀粉酶具有如下性质：最适温度20℃，最适pH 8.0，最适盐浓度为1M NaCl；作为一种新型的低温嗜盐酶制剂，可有效的用于食品、发酵、医药、皮革、酿造、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种低温嗜盐α-淀粉酶的基因克隆、表达及应用。

背景技术

α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，广泛分布于动物、植物和微生物中，在食品、发酵、医药、皮革、酿造等行业均有应用。但目前工业上应用较多的淀粉酶为中高温的α-淀粉酶，它们在0℃-20℃范围内活力很低，不适宜用于要求低温处理的食品、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。而低温α-淀粉酶能克服中高温淀粉酶在这方面的缺陷，在30℃以下表现出良好的催化活性，且在0℃保持酶活性。它能更好的提高生产效率和产品质量，可以降解有机污染物、生产洗涤剂添加剂、生产精细化学药品以及用去除土壤和水作用域中的污染物和有毒物质等，具有很高的工业应用价值。然而，目前对低温α-淀粉酶的研究还比较少，商业化的低温α-淀粉酶就更少，因此要满足工业需求，新型低温淀粉酶的不断发现研究和规模化生产就显得尤为重要了。

随着全球范围内节能环保的日益重视，低温α-淀粉酶在工业中的应用就显得愈发重要，因此，开展新型低温α-淀粉酶及其环境适应性的研究，具有较好的理论价值与市场开发前景，其应用的社会意义和生态效应重大。此外，国内外筛选出多种新的淀粉酶菌株，但普遍因为活性差或者稳定性不高、或者逆境适应能力不强等原因，限制了在工业上的应用。因此，如何得到性质优良，表达活力高的菌株成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于极地适冷细菌Pseudoalteromonas sp.AN175的低温嗜盐α-淀粉酶基因克隆、表达及应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

本发明提供一种低温嗜盐α-淀粉酶的基因克隆与表达方法，具体包括如下步骤：

(1)引物的设计与合成：根据测序所得的低温α-淀粉酶基因序列，设计的引物为：

上游TAC-F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC>

下游TAC-R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC>

引物分别带有BamH I和Xho I两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC-F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC-R5的酶切位点为“CTCGAG”；

(2)目的基因的扩增：提取Pseudoalteromonas sp.AN175细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC-F7、TAC-R5来扩增目的基因；

(3)重组质粒的构建：利用BamH I与Xho I两种限制性内切酶对PCR回收产物以及表达载体进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收；将酶切后的目的基因及表达载体的纯化产物进行连接。

(4)重组基因工程菌的构建：将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；

(5)低温淀粉酶基因的诱导表达：

①将含重组质粒的单菌落接种于50mL LB液体培养基(含Kana)的250mL锥形瓶中，37℃过夜培养；

②取5mL过夜的菌液于装有250mL LB液体培养基(含Kana)的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6时，在诱导瓶中加入100mM>

④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌的全部菌液进行离心处理，将离心的菌体加入二氧化硅和6mL预冷的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，置于冰水中进行超声破碎；收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；

(6)目的蛋白的纯化：采用凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行目的蛋白纯化，200mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测，获得纯化的低温嗜盐α-淀粉酶。

根据上述基因克隆与表达方法，得到一种低温嗜盐α-淀粉酶基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1；该基因编码的低温嗜盐α-淀粉酶，其氨基酸序列为：SEQ ID NO：2；其信号肽的基因序列为：SEQ ID NO：3，氨基酸序列为：SEQ ID NO：4。

本发明低温嗜盐α-淀粉酶基因也可以是编码由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何核苷酸序列。

本发明低温嗜盐α-淀粉酶不仅限于SEQ ID NO：2序列表中所示的氨基酸序列，还可以是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的蛋白活性的由SEQ ID NO：2所示序列衍生的蛋白质的氨基酸序列。

本发明提供一种低温嗜盐α-淀粉酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取酵母浸粉5.0g，四水磷酸铁0.1g，氯化钙5.0g，可溶性淀粉10g，氯化钠50g，用过滤陈海水定容至1000ml，pH 6.0，121℃湿热灭菌20min，制备发酵培养基，将活化的Pseudoalteromonas sp.AN175菌种接种至发酵培养基中进行菌种培养；

(2)取培养9天后的粗酶液进行硫酸铵沉淀纯化，将所得的酶液装入透析袋透，PEG-20000浓缩至10ml；

(3)将上述酶液上DEAE-52离子交换柱，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行平衡，用含0.3M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱；

(4)将DEAE-52离子交换层析所得酶活高的峰值对应收集管酶液合并，用于Sephadex G-75凝胶层析上样；50mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液洗脱；用浓度为5％的浓缩胶、浓度为12％的分离胶电泳；考马斯亮蓝染色、脱色；

(5)分离纯化结果测定：采用DNS法测定淀粉酶活力，采用Brandford法测定蛋白质的含量。

本发明的有益效果为：

1.本发明对来源于极地适冷细菌Pseudoalteromonas sp.AN175的低温嗜盐α-淀粉酶基因进行了成功克隆和测序。建立该基因的克隆与表达方法，首次确定其全部基因序列，并在Genbank登记，登记号为KC306394.2。该基因全长1722bp，编码573个氨基酸，分子量10.3kDa，等电点4.9。

2.本发明所提供的低温嗜盐α-淀粉酶的分离纯化方法，并确定该酶具有如下性质：最适温度20℃，最适pH 8.0，0℃时仍有51.5％的活性，最适盐浓度为1M NaCl，5M NaCl时仍保持87.7％的活性。与其他酶类相比，该酶为一种具有适冷性和耐盐性的新型低温α-淀粉酶，可以在常温和高盐环境下保持高活性。

3.低温酶酶活及催化效率高，大大缩短反应时间并省去昂贵的加热系统，过程易于控制，节能环保。

4.温和的热处理即可使低温酶活力丧失，有助于提高产品质量。

5.作为一种新型的低温嗜盐酶制剂，通过对该酶进行基因克隆、表达、性质分析和功能研究，可将其用于食品、发酵、医药、皮革、酿造、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。

附图说明

图1为PCR扩增目的基因结果；

图2为转化大肠杆菌BL21的菌落PCR验证结果；

图3为淀粉酶的纯化结果；

图4为不同时间点的小量表达诱导结果；

图5为不同浓度IPTG的诱导结果；

图6为低温淀粉酶大量表达的结果；

图7为不同温度下的大量诱导；

图8为DEAE-52离子交换层析的结果；

图9为Sephadex G-75凝胶过滤层析的结果；

图10为不同温度对淀粉酶活性影响的测量；

图11为不同PH值对淀粉酶活性影响的测量；

图12为不同盐浓度对淀粉酶活性影响的测量。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

实施例1：淀粉酶基因的克隆与表达

(1)LB培养基的制备：

在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，然后用5M NaOH调pH至7.0，高温高压灭菌20min；

(2)引物的设计与合成：

根据测序所得的低温α-淀粉酶基因序列，设计引物为：

上游TAC-F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC>

下游TAC-R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC>

引物分别带有BamH I和Xho I两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC-F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC-R5的酶切位点为“CTCGAG”，引物均由上海生工生物有限公司合成；

(3)细菌基因组DNA的提取：

①取4mLAN175菌液于离心管中，12000rpm离心10min，倒上清，加入250μLTE缓冲液，溶解混匀；

②加入20μL 10％SDS溶液，缓慢摇匀，然后再加入2mg/mL的BBI溶菌酶10μL，37℃水浴1h；

③加入80μL 5M的NaCl溶液，混匀后再加入50μL CTAB与NaCl混合溶液(10％CTAB、0.5M的NaCl)，混匀后65℃水浴10min；

④加入500μL氯仿与异戊醇混合物，振荡混匀，10000rpm离心5min，所述氯仿与异戊醇的体积比为24∶1；

⑤吸取上清液于另一干净离心管中，加入500μL酚、氯仿和异戊醇的混合物，振荡混匀，10000rpm离心5min；

⑥吸取上清液于另一干净离心管中，并记下体积，加入0.6倍体积的异丙醇，振荡混匀，10000rpm离心10min；

⑦倒掉上清，彻底晾干，加入40μL ddH2O溶解DNA；

(4)PCR扩增目的基因：

以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC-F7、TAC-R5来扩增目的基因；

扩增体系的组分为：10×PCR Buffer-2.5μL，MgCl₂-1μL，dNTP>

扩增条件为：①94℃下5min，②94℃下45s，③55℃下1min，④72℃下1min，⑤重复步骤②-④35个循环，⑥72℃下10min；

电泳结果如图1所示，基因条带亮度及特异性均较好，图1中各标记注释为：M：DL2000；1、2：目的基因条带；

(5)目的基因与载体的双酶切构建了原核重组表达载体pET28-Amy：

用BamH I与Xho I两种限制性内切酶对经步骤一(4)PCR扩增后的回收产物以及表达载体pET-28a(+)进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收，反应条件为：37℃水浴3h，酶切体系的组分为：PCR回收产物或表达载体pET-28a(+)-40μL，2×Tango Buffer-5μL，BamHI酶-2.5μL，Xho I酶-2.5μL，共50μL；

(6)目的基因与载体连接后得到重组质粒：

将经步骤一(5)酶切后的目的基因与酶切后的表达载体pET28-Amy进行连接，并控制酶切后的表达载体pET28-Amy与酶切后的目的基因的摩尔比在1∶3-1∶8之间；连接体系的组成为：酶切后的表达载体pET28-Amy-1μL，酶切后的目的基因-7μL，10×LigationBuffer-1μL，T4DNA连接酶——1μL；连接反应条件为：16℃，过夜连接；

(7)重组基因工程菌的构建：

将上述重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；将测序成功的重组子提取质粒后，转化大肠杆菌BL21，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR，如图2所示，结果显示扩增出一条特异性的条带，大小与目的基因相等，证明转化成功；图2中各标记注释为：M；DL10000；1-4泳道为阳性克隆；

(8)低温淀粉酶基因的诱导表达：

①挑取空表达载体pET-28a(+)即阳性对照质粒和重组质粒的单菌落接种于50mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃过夜培养；

②取5mL过夜的菌液于装有250mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD600值约为0.6；每种3瓶，其中1瓶为诱导，1瓶不诱导，另一瓶备用；

③诱导瓶中，加入100mM IPTG至终浓度0.7mM，诱导2h，37℃摇床培养诱导表达；

④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌菌液和空表达载体菌液4℃，12000r/min，离心15min，离心管的容量小于等于50mL，离心3次以上，将离心的菌体加入二氧化硅和6mL预冷的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，置于冰水中进行超声破碎；参数设定：功率400w，工作2s，间隔2s，工作10min；于4℃，12000r/min，离心15min，收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；分别进行酶活力测定和SDS-PAGE检测；取上清液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达情况；

(8)目的蛋白的纯化：

诱导表达的工程菌经细胞裂解和离心后的上清液，经过凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行纯化；通过凝胶层析能去除上清液中的少量小分子量杂蛋白，目的蛋白为带有组氨酸标签的融合蛋白，用亲和层析使目的蛋白与固相化的配基特异性结合而滞留；

Ni-亲和层析的方法为：

①用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；

②5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO₄)充电；

③5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；

④10×柱体积的Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH8.0)平衡；流速控制在0.5-1mL/min；

⑤上样；

⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，收集流出液；

⑦Elution Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，100-1000mM咪唑，pH8.0)洗脱，每次1mL，应呈现两边稀，中间浓的正态分布；

⑧10×柱体积的Binding Buffer洗涤；

⑨用20％的乙醇充满柱子，保存在4℃；

在进行Ni-亲和层析的不同梯度咪唑缓冲液的梯度洗脱过程中，含200mM咪唑的缓冲液能够洗脱目标蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，如图3所示，在65kDa位置出现了1条特异的表达蛋白带；图3中各标记注释如下：M：marker6.5-200KDa；1：重组质粒大量诱导表达后超声波破碎的沉淀；2：含咪唑浓度200mM的洗脱液；3：含咪唑浓度300mM的洗脱液；

本实施方式中低温嗜盐α-淀粉酶基因全长1722bp，具体序列如下：

本实施方式中低温嗜盐α-淀粉酶的氨基酸序列包括753个氨基酸，序列如下：

本实施方式中低温嗜盐α-淀粉酶的信号肽的基因序列为：

本实施方式中低温嗜盐α-淀粉酶的信号肽的氨基酸序列为：

实施例2.一种低温α-淀粉酶在大肠杆菌中表达条件的优化

利用IPTG进行诱导，研究低温淀粉酶在大肠杆菌中的表达情况，并通过SDS-PAGE进行检测；

(1)不同时间点的小量表达诱导结果：如图4所示，诱导2h、4h、6h、8h、10h的的结果没有明显差异，所以诱导2h为最佳诱导时间；图4中各标记注释为：M：标准牛血清蛋白；1：空载体诱导4h；2：空载体诱导前；3：重组质粒诱导10h；4：重组质粒诱导8h；5：重组质粒诱导6h；6：重组质粒诱导4h；7：重组质粒诱导2h；8：重组质粒诱导前；

(2)不同浓度IPTG的诱导结果：在诱导温度为37℃，诱导时间为2h条件下诱导表达，研究不同IPTG浓度诱导对表达量的影响，由图5可知不同浓度的IPTG诱导对重组质粒的表达有一定影响，0.7mM的IPTG诱导蛋白表达量最大，所以0.7mM的IPTG为最佳诱导浓度；图5中各标记注释为：M：marker6.5-200KDa；1：重组质粒加入1.0mMIPTG诱导2h；2：重组质粒加入0.7mMIPTG诱导2h；3：重组质粒加入0.4mMIPTG诱导2h；

(3)低温α-淀粉酶大量表达的结果：在诱导温度为37℃，诱导时间为2h，IPTG浓度为0.7mM条件下诱导表达，经超声波破碎后，将细胞破碎上清液和沉淀溶解液进行SDS-PAGE检测，如图6所示，重组质粒大量诱导表达，目标蛋白主要以包涵体的形式出现在沉淀中，而上清液中几乎无目标蛋白；图6中各标记注释如下：1：空载体诱导前；2：重组质粒大量诱导表达前；3：重组质粒大量诱导表达后超声波破碎的上清液；4：重组质粒大量诱导表达后超声波破碎的沉淀；5：重组质粒诱导2h；M：marker6.5-200KDa；

(4)不同诱导温度下的大量诱导结果：由于诱导温度对包涵体的形成影响最大，选择诱导时间为2h，IPTG浓度为0.7mM条件下诱导表达，研究不同温度下诱导对蛋白表达量的影响；经超声波破碎后，将细胞破碎上清液和沉淀溶解液进行SDS-PAGE检测；如图7所示，在不同温度的诱导条件下，目标蛋白在10、20、30、37℃都以包涵体的形式存在，而上清液中基本无目标蛋白；说明不同温度下的大量诱导表达对包涵体的形成并无影响；图7中各标记注释如下：M：marker6.5-200KDa；1：重组质粒10℃大量诱导表达后超声波破碎的上清液；2：重组质粒10℃大量诱导表达后超声波破碎的沉淀；3：重组质粒20℃大量诱导表达后超声波破碎的上清液；4：重组质粒20℃大量诱导表达后超声波破碎的沉淀；5：重组质粒30℃大量诱导表达后超声波破碎的上清液；6：重组质粒30℃大量诱导表达超声波破碎后的沉淀；7：重组质粒37℃大量诱导表达后超声波破碎的上清液；8重组质粒37℃大量诱导表达后超声波破碎的沉淀；

诱导表达条件优化结果显示，最佳诱导温度为37℃、诱导时间为2h，IPTG诱导浓度为0.7mM/L。低温α-淀粉酶大量表达的试验结果表明，在上述既定的条件下进行大量表达后，目标蛋白主要以包涵体的形式出现在沉淀中，而上清液中几乎无目标蛋白。不同诱导温度下的大量诱导的试验结果表明，低温培养对大量诱导表达对所形成的包涵体并无影响。其原因尚未知晓，因此目前采用包涵体处理的方法对目的蛋白进行处理。

实施例3.一种低温嗜盐α-淀粉酶，其制备方法如下：

(1)制备发酵培养基：取酵母浸粉5.0g，四水磷酸铁0.1g，氯化钙5.0g，可溶性淀粉10g，氯化钠50g，用过滤陈海水定容至1000ml，pH 6.0，121℃湿热灭菌20min；

(2)菌种培养：按2％接种量将活化的Pseudoalteromonas sp.AN175菌种接种至500ml锥形瓶中，发酵培养基的装液量为150ml，在摇床中130rpm震荡培养9d；

(3)硫酸铵沉淀纯化：将装有粗酶液的烧杯置于装有冰水的大烧杯内，并在磁力搅拌器上搅拌，缓慢加入研细的固体硫酸铵，使粗酶液饱和度达70％的最佳浓度，于4℃陈化24h；7500rpm，4℃，离心20min，弃去上清液，将沉淀溶于50mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中，4℃，12000rpm离心20min，将没有溶解的沉淀弃去，上清液即为硫酸铵沉淀纯化的酶液；将所得的酶液装入透析袋透，PEG-20000浓缩至10ml，所述粗酶液是经上述步骤(2)培养9d后的上清液；

(4)DEAE-52离子交换层析：取上述步骤(3)所得的硫酸铵沉淀纯化的酶液(1)上DEAE-52离子交换柱，先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行平衡，再分别用以50mMTris-HCl缓冲液配制的含0.1M NaCl，0.2M NaCl，0.3M NaCl，0.5M NaCl溶液分别进行洗脱；

DEAE-52离子交换层析的结果见图8，由图8可得在洗脱盐度为0.3M时，有淀粉酶活力峰，将28～32管适当浓缩至6ml，由淀粉酶的纯化结果，经过离子交换后，酶的总活力和比活力分别变为1157.4U和2893.4U/mg，相对粗酶液纯化6.3倍，总回收率为3.1％；

(5)Sephadex G-75凝胶层析：将DEAE-52离子交换层析所得酶活高的峰值对应收集管酶液合并，用于Sephadex G-75凝胶层析上样；50mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液洗脱；用浓度为5％的浓缩胶、浓度为12％的分离胶电泳；考马斯亮蓝染色、脱色；

淀粉酶凝胶过滤分离的结果见图9，由图9可知凝胶过滤后，测A280有两个蛋白质峰，分别在3～6管，9～12管出现，将其分别浓缩后测定其淀粉酶活力，第二个峰有活力，但活力较低；由淀粉酶的纯化结果，经过Sephadex G-75凝胶过滤层析后，酶的总活力和比活力分别变为312.1U和10400.3U/mg，相对粗酶液纯化22.7倍，总回收率为0.84％；

(6)分离纯化结果测定：对经过硫酸铵沉淀纯化、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析三个步骤得到的分离纯化的低温淀粉酶，测定淀粉酶的活力和蛋白质的含量；

①淀粉酶的活力的测定方法为：淀粉酶活力测定采用DNS法；用pH 5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液配制的1％淀粉为底物，取1ml底物在40度下保温1min，加入同样温度的1ml淀粉酶酶液，在40℃下反应10min后，立即加入2ml DNS试剂中止反应，然后在沸水浴中保温10min。用分光光度计在540nm下测定OD值；酶活力单位定义为在40℃，pH 5.6条件下1ml酶液每分钟产生1μg还原糖所需要的酶量，还原糖以麦芽糖计；

②蛋白质的含量的测定采用Brandford法；

③淀粉酶的纯化结果为：

所述纯化倍数是指每个纯化步骤所得比活力与粗酶液比活力的比值；

总回收率是指每个纯化步骤所得蛋白含量与粗酶液蛋白含量的的比值。

实施例4酶的性质分析

(1)不同温度对酶活性的影响：试验表明，菌株AN175所分泌的淀粉酶的最适反应温度为30℃(图10)，低于一般淀粉酶。在20～35℃有80％以上的酶活，45℃时的酶活仅为30℃时的40％；

(2)不同PH值对酶活性的影响：如图11所示，酶活力在pH值为8.0时最高，但该酶耐酸性较好，在试验测定的4.0～7.0的pH值范围内酶活性保持在86.8％以上，反应体系的pH为9.0和10.0时酶活分别比8.0时下降了21.2％和30.4％，碱性较强的条件不适于该酶的催化；

(3)不同盐浓度对淀粉酶活性的影响：如图12所示，最适盐浓度为1M NaCl，5MNaCl时仍保持87.7％的活性；

(4)不同金属离子对酶活性的影响：

结果显示：Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺对酶有明显的激活作用，其中钙离子的激活作用最强，活性可提高164％，Cu²⁺和Hg²⁺对酶活性有明显的抑制作用。

这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中，因此，本发明不受本实施例的限制，任何采用等效替换取得的技术方案均在本发明保护的范围内。