荔枝果肉多酚的分离鉴定及其调节脂质代谢作用机制

摘要

荔枝(LitchichinensisSonn.)是热带亚热带地区重要的代表性水果。我国荔枝种植面积和产量均居世界第一。由于荔枝采收期集中，且不耐储藏，精深加工成为推动荔枝产业健康、可持续发展的主要出路。作为岭南地区的代表性珍稀果品，荔枝自古被认为具有一定的滋补功效。探明其健康效应的物质基础和作用机理对于指引荔枝的精深加工方向有重要意义。虽然已经有研究从现代药理学角度报道了荔枝果肉的抗氧化、抗辐射和保护肝脏等功效，然而上述各项研究尚未涉及其活性物质基础。项目组及国内外同类研究结果表明荔枝果肉富含酚类物质，具有明显的抗氧化活性，但对果肉中各种单体酚类物质的活性差异还缺乏认识。大量研究表明多种不同来源的酚类物质对改善机体血脂代谢有明显作用。荔枝果肉多酚作为亚热带地区居民重要的膳食多酚来源对于脂质代谢的影响尚未见研究报道。为此，本研究在确定荔枝果肉多酚最佳提取条件的基础上，探讨其对高脂血症小鼠脂质代谢的调节作用，通过分析摄入荔枝果肉多酚对血脂代谢相关microRNA及其下游靶基因表达的影响，探明其调节脂代谢分子机制;进而在体外活性跟踪下鉴定出荔枝果肉主活性单体组分。研究结果对促进荔枝消费、指导荔枝功能食品精深加工、推动荔枝产业可持续发展具有重要意义。
　　1.不同提取方法对荔枝果肉游离酚和结合酚及其抗氧化活性的影响:分别用不同极性5种溶剂提取荔枝果肉游离酚，采用酸水解法和碱水解法提取结合酚，采用氧自由基吸收能力分析(ORAC)法和细胞抗氧化分析（CAA）法测定其游离酚和结合酚的抗氧化活性。结果表明，荔枝果肉丙酮提取物游离酚含量最高。该方法提取后的果肉残渣分别采用酸水解法和碱水解法提取结合酚发现前者的提取效率是后者的2倍。不同溶剂提取的荔枝果肉游离酚中丙酮提取物的ORAC抗氧化活性最高。但丙酮与甲醇提取物的CAA抗氧化活性相当，高于乙醇和乙酸乙酯提取物，水提物CAA值最低。酸水解法得到的结合酚ORAC值和CAA值分别是碱法的2.6和1.9倍。上述结果表明丙酮水溶剂体系适于荔枝果肉游离酚提取，酸水解法较碱水解法适于提取荔枝果肉结合酚提取。
　　2.荔枝果肉多酚大孔树脂分离工艺优化:比较11种不同极性大孔树脂对荔枝果肉酚类提取物中总酚和总黄酮的静态吸附和解吸性能，优化其最佳大孔树脂动态吸附和解吸工艺参数;通过HPLC方法对所得组分酚类物质种类及其含量变化进行分析。HPD-826大孔树脂分离纯化荔枝果肉总酚和总黄酮效果最好，其吸附和解吸工艺参数为:荔枝果肉酚类提取物上样浓度0.8mg/mL，上样速度3.0BV/h，95％乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱流速3.0BV/h。经HPLC分析和鉴定，HPD-826分离纯化荔枝果肉酚类不会造成单体酚组成变化和明显损失;荔枝果肉酚类物质主要由3，4-二羟基苯甲酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、高儿茶酚、阿魏酸和芦丁等9种单体组成，其中含量最高的依次是高儿茶酚、芦丁和表儿茶素，三者合计占到总量的94.37％。
　　3.荔枝果肉多酚对高脂膳食小鼠的脂质代谢调控作用及其机制:以C57BL/6J雄性小鼠为研究对象，动物分为对照组，高脂模型组和荔枝多酚组。荔枝多酚组摄入高脂膳食的同时通过灌胃摄入剂量为500mg/kg·d的荔枝果肉多酚大孔树脂纯化提取物。10w后结束实验，酶法分析各组动物血清和肝脏中脂代谢相关指标，采用实时定量PCR分析荔枝果肉多酚对高脂膳食小鼠肝脏miR-33、miR-122和miR-370及其靶基因ABCA1、Fas和Cpt1等mRNA水平，并通过Westernblotting分析ABCA1、Fas和Cpt1a等蛋白的表达情况。结果表明，荔枝多酚组较高脂组小鼠血清总甘油三酯和总胆固醇含量降低，高密度脂蛋白含量增加;摄入荔枝果肉多酚可以明显减轻高脂膳食诱导的肝脏脂肪变性;与高脂膳食模型组比较荔枝果肉多酚可降低小鼠肝脏miR-33和miR-122表达水平，下调其靶基因Fas的表达水平，上调ABCA1和Cpt1a的表达。提示荔枝果肉多酚通过调节miR-33和miR-122及其下游相关基因的表达水平，促进肝脏胆固醇外运和高密度胆固醇形成，同时降低脂肪酸合成并加速其氧化利用，从而发挥调节血脂的作用。
　　4.荔枝果肉多酚的的结构鉴定及其细胞抗氧化活性:为进一步探明荔枝果肉主要活性酚类物质单体组成，本研究采用聚酰胺树脂对上述经HPD-826型大孔树脂分离的荔枝多酚提取物进行进一步纯化，并采用CAA和ORAC活性跟踪评价不同级分抗氧化活性，以分离出其主要抗氧化级分。对抗氧化活性高的级分经制备型反相液相色谱纯化获得3个单体组分，经ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR和HMBC谱分别鉴定为槲皮素-3-O-素芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁和表儿茶素。此3种黄酮类化合物的含量依次为17.25mg/100gFW、3.58mg/100gFW和2.31mg/100gFW。HPLC鉴定的荔枝果肉中含量最高的高儿茶酚经波谱确证为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。其显示出较好的CAA活性，与广泛报道的木屐草素相当，较桑色素和二氢杨梅素高。上述结果表明槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷是荔枝果肉中含量最高，抗氧化活性最强的单体酚类成分。因此，该化合物可能是荔枝果肉发挥抗氧化及脂代谢调控等作用的主活性酚类单体。
　　本研究的主要创新点:①建立了荔枝荔枝果肉中游离酚和结合酚的提取分离纯化方法，首次从荔枝中分离鉴定出酚类物质槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷，并确证其是荔枝果肉多酚抗氧化作用的主活性组分。②发现并确证荔枝果肉多酚降低高脂血症小鼠的血脂水平并改善其血脂代谢作用，首次从其调节miR-33、miR-122和miR-370及其靶基因ABCA1、Fas、Cpt1a等mRNA和蛋白表达水平变化的角度，明确了荔枝酚类物质调节脂代谢的分子机制。
　　本研究鉴定的荔枝果肉酚类物质为揭示其健康效应提供了物质基础;从植物多酚调节miRNA及其靶基因mRNA表达水平变化的角度阐释荔枝果肉多酚调节血脂的生物活性，为其它果蔬的生物活性作用与分子机制研究提供了新方法和新思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 立题背景及意义

1．2 多酚研究概况

1．2．1 多酚分离纯化

1．2．2 多酚结构鉴定

1．2．3 多酚的生物活性

1．3 荔枝多酚研究进展

1．3．1 荔枝果皮多酚

1．3．2 荔枝果核和花多酚

1．3．3 荔枝果肉多酚

1．4 植物多酚调控脂质代谢机制的研究进展

1．4．1 植物多酚调节血脂代谢酶

1．4．2 植物多酚调节脂代谢miRNA

1．5 关键科学问题的提出及主要研究目标

1．5．1 问题的提出与解决思路

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

第2章 不同提取方法对荔枝果肉游离酚和结合酚及其抗氧化活性的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂及仪器

2．2．3 荔枝果肉游离酚提取工艺

2．2．4 荔枝果肉结合酚提取工艺

2．2．5 化学法测定荔枝果肉酚类物质含量

2．2．6 HPLC法测定荔枝果肉酚类物质组成及含量

2．2．7 荔枝果肉游离酚和结合酚细胞抗氧化活性

2．2．8 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 不同溶剂提取荔枝果肉游离酚效果比较

2．3．2 酸法和碱法提取荔枝果肉结合酚效果比较

2．3．3 不同提取溶剂对荔枝果肉游离酚组成的影响

2．3．4 不同提取方法对荔枝果肉结合酚组成的影响

2．3．5 不同提取溶剂对荔枝果肉游离酚抗氧化能力的影响

2．3．6 不同提取方法对荔枝果肉结合酚抗氧化能力的影响

2．4 讨论

2．4．1 不同提取方法对游离酚和结合酚提取效果的影响

2．4．2 不同提取方法对游离酚和结合酚单体组成的影响

2．4．3 不同提取方法对荔枝果肉游离酚和结合酚抗氧化能力的影响

2．5 小结

第3章 荔枝果肉酚类物质大孔树脂分离纯化工艺优化

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要试剂及仪器

3．2．3 荔枝果肉多酚提取工艺

3．2．4 不同极性大孔树脂静态吸附量及解吸率实验

3．2．5 大孔树脂静态吸附动力学曲线

3．2．6 大孔树脂动态吸附和解吸实验

3．2．7 荔枝果肉单体酚组成及含量HPLC分析

3．2．8 统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同大孔树脂对荔枝果肉多酚静态吸附与解吸的影响

3．3．2 HPD-826型大孔树脂吸附荔枝果肉多酚的动力学

3．3．3 荔枝果肉多酚样品浓度对HPD826大孔树脂吸附性能的影响

3．3．4 荔枝果肉多酚上样流速对HPD826大孔树脂吸附性能的影响

3．3．5 洗脱液浓度对HPD-826大孔树脂解吸性能的影响

3．3．6 HPD-826型大孔树脂吸附对荔枝果肉多酚单体组成的影响

3．4 讨论

3．4．1 大孔树脂极性对荔枝果肉酚类物质吸附性能的影响

3．4．2 吸附和解吸条件对大孔树脂性能的影晌

3．4．3 大孔树脂吸附对荔枝果肉酚类物质组成的影响

3．5 小结

第4章 荔枝果肉多酚对高脂膳食小鼠的脂质代谢调控作用及其机制

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要试剂及仪器

4．2．2 荔枝果肉多酚制备

4．2．3 实验设计及动物分组

4．2．4 小鼠肝脏H＆E染色

4．2．5 小鼠血清和肝脏理化指标

4．2．6 小鼠肝脏RNA提取

4．2．7 实时定量PCR测定小鼠肝脏miR-33、miR-122和miR-370

4．2．8 实时定量PCR测定小鼠肝脏ABCA1、Fas和Cpt1a等mRNA

4．2．9 蛋白免疫印记测定小鼠肝脏ABCA1、Fas、Cpt1a和SREBP-1c

4．2．10 统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 小鼠的体重及生长情况

4．3．2 小鼠肝脏的病理变化

4．3．3 小鼠血液和肝脏生化指标

4．3．4 小鼠肝脏miR-33、miR-122和miR-370表达水平

4．3．5 小鼠肝脏ABCA1、Fas和Cpt1a等mRNA表达水平

4．3．6 小鼠肝脏Fas、Cpt1a、ABCA1和SREBP-1c等蛋白表达情况

4．4 讨论

4．4．1 植物多酚对脂质代谢的调控作用

4．4．2 植物多酚对脂代谢基因及其相关酶表达水平的调控作用

4．4．3 植物多酚对miR-33和miR-122表达水平的调控作用

4．5 小结

第5章 荔枝果肉多酚结构鉴定及其细胞抗氧化活性

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 主要试剂及仪器

5．2．3 活性跟踪法纯化荔枝果肉酚类物质

5．2．4 荔枝果肉主抗氧化酚类物质制备

5．2．5 荔枝果肉主抗氧化酚类物质结构鉴定

5．2．6 荔枝果肉主抗氧化酚类物质细胞抗氧化活性

5．2．7 统计分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 活性跟踪法筛选荔枝果肉主抗氧化级分

5．3．2 荔枝果肉酚类物质结构鉴定

5．3．3 荔枝果肉主抗氧化组分及常见抗氧化物质细胞抗氧化活性比较

5．4 小结

主要结论

创新点

展望

参考文献

论文补充材料

在读期间研究成果

致谢