荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法

摘要

本发明公开了一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，通过对荔枝果肉中原花青素、黄酮类物质等4段不同的酚类成分的分离，获得这4段酚类成分对油酸诱导的肝细胞内脂质聚集的抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法。

背景技术

荔枝是亚热带地区的主要特色水果，因其果皮鲜艳美观、肉汁细腻香甜而深受国内外消费者的喜爱，被誉为“果中珍品”。我国是荔枝的主产国，种植面积和产量均居世界第一。广东省作为荔枝的主产区其产量占全国荔枝总产量的60％以上。由于荔枝上市时间集中，且保鲜时间短，鲜销市场压力巨大。如何开展荔枝的精深加工，缓解鲜销市场压力，提高荔枝的附加值成为一个亟待解决的问题。

自古以来，很多古医书中都记载有荔枝的各种保健作用，《本草纲目》记载：“常食荔枝能补脑健身，治疗瘰疬，开胃益脾；干制能补元气，可作为产妇及老弱者的补品”；《滇南本草》称其“暖补脾精，滋补肝血”。然而，截至目前，对于荔枝中具有保健作用的物质基础以及其发挥生物活性的作用机制还缺乏清晰的认识。已有研究表明，荔枝果肉中富含多酚类物质，并发现其具有减轻拘束应激引起的小鼠肝脏损伤、抑制高脂膳食诱导的小鼠肝脏脂肪变性，降低血脂水平等作用。然而，在上述研究中，所采用的都是荔枝果肉多酚的提取物，其多酚类成分组成复杂。酚类物质是一大类植物次生代谢产物，不同的化合物因其结构的差异活性会有明显的不同。上述研究虽然发现了荔枝果肉多酚具有护肝、降血脂等的生物活性，其中具体的作用成分却并不明确。

为了探明某些原料中的有效活性成分，传统的研究思路是利用植物化学的方法将其逐步分离纯化制备出一个个的单体，再对其活性逐一进行比较，找出其中活性最强的一个或几个成分，认定为该原料中主要的活性成分。然而，近来的研究观点认为植物活性物质发挥药理活性的往往不是某种单一的化学成分而是一组成分群的共同作用。采用上述方法会割裂成分间的有机关联与交互作用，难以体现其产生的协同或拮抗等共同作用特点。而且，这样的研究工作操作繁杂，研究成本高，甚至可能因实验条件限制而无法实现。若将荔枝果肉分成不同的酚类成分群，对其活性分别进行比较不仅考虑了某些含量较低或单独作用活性较弱的成分对主要活性成分可能具有的协同增效作用，确定出更接近提取物作用效果的有效酚类成分群，而且较逐个分离化合物可以提高工作效率。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的在于克服现有技术的不足，提供一种简化的荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，解决化合物逐一分离制备荔枝果肉多酚活性成分烦琐耗时，且容易忽略化合物间的协同作用的问题。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备荔枝果肉多酚提取物；

S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；

S3、上样于C₁₈硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1～2％的乙腈水(v/v)和组合液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，所述组合液包括含有0.2％冰乙酸的体积百分比浓度为10～35％的甲醇水溶液；

收集1％、2％乙腈洗脱液和10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液洗脱液，单独收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液；

S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5～2倍后，上样到HPD100型大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群，F1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

其中，步骤S3中10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指用含有体积百分比浓度10％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有体积百分比浓度15％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集；20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指用含有体积百分比浓度20％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液洗脱后收集；25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液是指用含有体积百分比浓度25％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有体积百分比浓度30％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集；35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指含有体积百分比浓度35％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集。

荔枝果肉多酚提取物经过AB-8大孔树脂初步纯化后，成分还是比较复杂，里面的酚类成分有些在抑制肝细胞脂质聚集中有效果，有些没有活性，但是如果一一进行分离研究又非常的烦琐，而且很有可能有些成分单独不起作用却能够增强其它成分的作用，如果采用一一分离的方法，这些辅助性化合物的作用就会被忽视，因此，最终分离到的有效成分的作用并不能达到粗提物共同作用的效果。基于这样的一个思路，我们想要发明一种简化的可以分离出主要活性成分的植物活性物质纯化方法。

将荔枝果肉多酚提取物上硅胶柱，利用不同类型的化合物因其极性等的差异与硅胶柱的吸附力不同，采用不同极性的洗脱剂进行分步洗脱将其分离。结合液相色谱检测和活性分析，发现用1％、2％乙腈洗脱液和10％甲醇水、15％甲醇水洗脱下来的成分活性均较低，这一部分进行合并(F1)；20％甲醇水洗脱液部分(F2)，还有25％和30％甲醇水洗脱液部分(F3)的活性都比较好，35％甲醇水洗脱液部分(F4)活性也比较差。

后续采用HPD100大孔吸附树脂处理的过程主要是为了脱去洗脱液中的水分。由于上述洗脱液水分含量较高，如果进行旋蒸和浓缩处理的话，因为酚类物质对温度等较敏感，会造成较多的降解，同时能耗也非常大。因此，将洗脱液上到大孔吸附树脂上，洗脱液中的多酚类成分会与树脂进行结合，再利用甲醇将结合的酚类物质洗脱下来，甲醇洗脱液可以较快的旋蒸去除有机溶剂进而得到目标分离物质。在大孔树脂上样前对洗脱液用蒸馏水做1.5～2倍稀释，目的是为了降低上样液中有机溶剂的浓度，因为有机溶剂含量高时会影响酚类物质与大孔树脂的吸附，造成酚类物质流失。

在确定有效活性组分的过程中，考虑到有些成分单独无明显活性但是可能会其它对其它成分的协同增效作用，因此在确定出F2和F3活性较好后，还进一步参照各部分在粗提物中的构成比例进行配合，观察在F2和F3的基础上再添加F4后活性是否有变化，发现没有进一步提高其活性，因此，确定出F2和F3为荔枝果肉多酚抑制肝细胞脂质聚集的主要酚类成分，所以最后对这两部分进行了合并。

进一步地，步骤S1的具体步骤如下：

S11、制备荔枝果肉多酚粗提液：新鲜荔枝果肉浸泡在0～4℃预冷的95％食用酒精中，均质，离心后收集上清液，于45～55℃条件下减压回收乙醇，残留的水溶液为荔枝果肉多酚粗提液；

此部分主要是旋蒸的温度会影响多酚的稳定性，温度过高容易造成多酚氧化和降解

S12、将步骤S11中制得的荔枝果肉多酚粗提液经过大孔树脂吸附后，蒸馏水洗脱以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用65～75％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于45～55℃减压浓缩，得到深黄色浓缩液，真空冷冻干燥后即为荔枝果肉多酚提取物。

此步骤主要是大孔树脂类型会影响纯化酚类物质的得率，优选AB-8但不局限于AB-8这一种树脂，HPD826等几种树脂都有较好的分离效果；旋蒸的浓度如上会影响多酚的稳定性。

优选地，步骤S11中浸泡时新鲜荔枝果肉与95％食用酒精的料液比为1∶(2～3)w/v。

此处控制食用酒精的用量主要是考虑到节约原料，增大料液比，如增到1：4～5后，多酚提取率会略有提高，但浪费太多酒精，因此对料液比进行适当限制。

其中，步骤S3的上样条件：上样流速为5～6BV/h，上样量与C₁₈硅胶填料质量比为1∶80～100，优选采用15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅胶层析柱。步骤S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积都是3.5～4BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为14～16BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为5～6BV，洗脱流速均为5～6BV/h。

上样量与硅胶填料的质量比会影响最终结果，上样量太低耗时，不经济，上样量太高而超过硅胶柱吸附量会造成样品损失。洗脱液体积会影响最终结果，体积太小洗脱不完全，体积太大造成溶剂浪费。

洗脱溶剂种类会影响结果，溶剂种类和浓度的改变会影响其极性，从而会影响洗脱液中酚类成分的构成。

步骤S4中用于冲洗的蒸馏水为2.5～3BV。步骤S4的洗脱流速为5～6BV/h。

树脂类型会影响最终结果，不同类型的树脂对不同种类的化合物吸附效果不同，如树脂类型不合适，吸附率低，或解析率低的现象，从而使最终得率降低。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对荔枝果肉中原花青素、黄酮类物质等4段不同的酚类成分的分离，获得这4段酚类成分对油酸诱导的肝细胞内脂质聚集的抑制作用，可用于制备调节脂质代谢，抑制肝脏脂肪变性的降血脂、护肝的药物或功能食品。

附图说明

图1为C18硅胶柱分离荔枝果肉不同酚类成分群的HPLC谱；

图2为荔枝果肉多酚提取物抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图3为荔枝果肉多酚提取物抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图4为纯化得到的F1抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图5为纯化得到的F1抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图6为纯化得到的F2抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图7为纯化得到的F2抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图8为纯化得到的F3抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图9为纯化得到的F3抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图10为纯化得到的F4抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图11为纯化得到的F4抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图12为复配物F2+F3抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图13为复配物F2+F3抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

图14为复配物F2+F3+F4抑制HepG2细胞内甘油三酯(TG)的时效与量效关系图；

图15为复配物F2+F3+F4抑制HepG2细胞内总胆固醇(TC)的时效与量效关系图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，包括如下步骤：

S1、制备荔枝果肉多酚提取物，包括如下步骤：

S11、制备荔枝果肉多酚粗提液：新鲜荔枝果肉浸泡在4℃预冷的95％食用酒精中，均质，离心后收集上清液，于45℃条件下减压回收乙醇，残留的水溶液为荔枝果肉多酚粗提液；

S12、将步骤S11中制得得的荔枝果肉多酚粗提液经过AB-8大孔树脂吸附后，蒸馏水洗脱以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于45℃减压浓缩，得到深黄色浓缩液，真空冷冻干燥后即为荔枝果肉多酚提取物；

S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；

S3、上样于15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1～2％的乙腈水(v/v)和体积百分比浓度为10～35％的甲醇/0.2％冰乙酸水溶液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，收集1％、2％乙腈洗脱液和10％、15％甲醇水洗脱液合并液，单独收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液；

S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5倍后，上样到15cm×6.0cm，60μm的HPD100型大孔吸附树脂柱，先用2.5BV蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，洗脱流速为5BV/h，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群，F1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

步骤S11中浸泡时新鲜荔枝果肉与乙醇溶液的料液比为1∶2w/v。

其中，步骤S3的上样条件：上样流速为5BV/h，上样量与C₁₈硅胶填料质量比为1∶100。步骤S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积都是3.5BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为14BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为5BV，洗脱流速均为5BV/h。

下面通过实验检测其收集组分的活性，具体如下：

1、荔枝果肉各酚类成分群的得率及酚类含量：所得四个成分群的得率占比为1.11∶2.15∶1∶1.26。其总酚和总黄酮含量如下表。

表1 荔枝果肉不同酚类成分群的得率占比及酚类含量

*:成分群对荔枝果肉多酚的百分比贡献率；同一列不同字母表示差异显著(p<0.05)

2、荔枝果肉各酚类成分群单体酚组成及含量分析：称取适量的各待测样品溶解在甲醇中配制成浓度为2mg·mL^-1的溶液，经0.22μm滤膜过滤后进行组分分析。HPLC-DAD检测条件：流动相A为0.4％(v/v)的乙酸，流动相B为乙腈，洗脱梯度为0-40min>

由图1可以看出，F1组分主要分离到LPP中1号峰之前出峰的成分，1-4号峰这段内的成分纯化到F2组分中，而含量最高的5号峰集中在F3段，5号峰之后的成分则集中分部在F4段。

3、荔枝果肉多酚提取物对HepG2细胞内脂质聚集的影响：将生长状态良好的HepG2细胞以5×10⁵/mL浓度接种于12孔细胞培养板，每孔1mL，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养24h。待细胞融合至70％-80％时，吸弃旧的培养液，向各孔中加入1mL>

甘油三酯含量测定：HepG2细胞经相应处理完成后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，采用北京普利莱基因技术有限公司的甘油三酯(组织细胞)酶法测定试剂盒，向每孔中加入130μL裂解液，振荡提取10min，取适量上清液转移至0.5mL离心管中，2000rpm/min离心5min，分离上清液用BCA法测定蛋白含量；同时，取10μL上清液加入190μL酶工作液，室温下反应10min，酶标仪550nm处测定吸光度值，以甘油标准品绘制标准曲线得回归方程，根据样品反应后的吸光值计算TG浓度，以每mg蛋白浓度校正各组细胞内TG含量。以油酸模型组作参比，计算各浓度样品组TG相对含量。

总胆固醇酶法测定：HepG2细胞经相应处理完成后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，用北京普利莱基因技术有限公司的总胆固醇(组织细胞)酶法测定试剂盒，向每孔中加入130μL裂解液，振荡提取10min，取适量上清液转移至0.5mL离心管中，2000rpm/min离心5min，分离上清液用BCA法测定蛋白含量；取10μL上清液加入190μL总胆固醇含量测定酶工作液，室温下反应20min，酶标仪550nm处测定吸光度值，以胆固醇标准品绘制标准曲线，根据吸光值计算样本中TC浓度，以每mg蛋白浓度校正各组细胞内TC含量。以油酸模型组作参比，计算各浓度样品组TC相对含量。

图2、3为不同浓度荔枝果肉多酚提取物(LPP)对油酸诱导的HepG2细胞内甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)聚集的抑制作用。不同浓度的LPP对细胞内脂质沉积均具有一定的抑制作用，但各浓度的抑制效果之间无明显差异。

图4～11为纯化得到的F1～F4四个酚类成分群对HepG2细胞内脂质聚集的抑制作用。整体来看，4个酚类成分群中，F2成分群抑制HepG2细胞内TG沉积的效果最好，5μg/mL时细胞内TG含量下降了26.9％，10μg/mL时达到最大抑制率为28％，两者无明显差异，但随着浓度的进一步增加，抑制效果反而逐渐减弱。F3对细胞内TG沉积的抑制作用仅次于F2，浓度为10μg/mL时细胞内TG含量即下降26.2％，接近于F2的最大抑制率；20μg/mL时达到最大抑制率为28.5％。F4的抑制效果相对较弱，在20μg/mL浓度时才达到最大抑制率为19.3％。而F1的抑制效果最差，40μg/mL时才具有一定抑制作用，细胞内TG含量仅下降11％。4个酚类成分群对HepG2细胞内TC含量的抑制率趋势与TG的结果一致，抑制作用从强到弱顺序亦为F2>F3>F4>F1。表明F2和F3成分群对油酸诱导肝细胞脂质聚集有明显的抑制作用。

对比图2、3和图4～11结果可以发现，同样在5μg/mL作用浓度下，F1～F4四个成分群对油酸诱导的肝细胞内脂质聚集的抑制作用要低于LPP，提示上述四个成分群单独作用无法解释LPP对肝细胞脂质聚集的抑制作用，各成分群之间可能存在协同或相加作用。进而，根据各酚类成分群的得率，以活性最好的成分群F2为基础，与F3按2.15:1的质量比复配，为复配物F2+F3；进一步将F2、F3与F4按2.15:1:1.26的质量比复配，为复配物F2+F3+F4。将上述制得的复配物，按上述同样的方法分别评价其对油酸诱导HepG2细胞内TG和TC含量的抑制作用。

图12～15为两种复配物对油酸诱导HepG2细胞内脂质聚集的抑制作用。由图可知，F2+F3复配物在低浓度1μg/mL时即对细胞内脂质聚集有一定抑制作用，与油酸处理的模型组相比，细胞内TG和TC含量均下降约15％，但随着浓度的进一步增加，其对细胞内脂质聚集的抑制作用并没有进一步增强，反而逐渐减弱，当浓度达到4μg/mL时已无抑制作用，表明在低浓度时F2和F3存在一定协同作用。F2+F3+F4复配物对HepG2细胞内脂质聚集的抑制作用与F2和F3复配物的结果类似，表明F4与F2和F3共同作用时未表现出更明显的协同效应。因此，F2和F3为荔枝果肉抑制肝细胞脂质聚集的主效酚类成分。

实施例2

一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，包括如下步骤：

S1、制备荔枝果肉多酚提取物，包括如下步骤：

S11、制备荔枝果肉多酚粗提液：新鲜荔枝果肉浸泡在0℃预冷的95％食用酒精中，新鲜荔枝果肉与95％食用酒精的料液比为1∶3w/v，均质，离心后收集上清液，于55℃条件下减压回收乙醇，残留的水溶液为荔枝果肉多酚粗提液；

S12、将步骤S11中制得的荔枝果肉多酚粗提液经过AB-8大孔树脂吸附后，蒸馏水洗脱以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用65％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于55℃减压浓缩，得到深黄色浓缩液，真空冷冻干燥后即为荔枝果肉多酚提取物。

S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；

S3、上样于15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1～2％的乙腈水(v/v)和体积百分比浓度为10～35％的甲醇/0.2％冰乙酸水溶液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，收集1％、2％乙腈洗脱液和10％、15％甲醇水洗脱液合并液，单独收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液；

S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5倍后，上样到15cm×6.0cm，60μm的HPD100型大孔吸附树脂柱，先用3BV蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，洗脱流速为6BV/h，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群，F1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

其中，步骤S3的上样条件：上样流速为6BV/h，上样量与C₁₈硅胶填料质量比为1∶80，优选采用15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅胶层析柱。步骤S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积都是4BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为16BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脱体积为6BV，洗脱流速均为6BV/h。

实施例3

除了S12步骤中用于洗脱的乙醇体积百分比为75％外，其他同实施例1。