猪STMN1基因在肌肉生长发育中功能的初步研究

摘要

Stathmin蛋白是一种微管解聚蛋白，主要通过磷酸化程度来调节自身的活性从而改变微管系统的动力平衡，进而参与调节细胞的增殖分化。研究表明STMN1基因在快速增殖分化的细胞中表达量高，在正常的组织细胞中基本不表达，在猪胚胎发育前期的肌肉组织中表达量高。本实验通过生物信息学对猪STMN1基因进行分析预测;克隆不同猪种STMN1基因的启动子和3'UTR区域;构建真核表达载体pcDNA3.1-STMN1和合成干扰小分子siRNA-STMN1转染C2C12细胞来上调/下调STMN1基因在C2C12细胞中的表达、利用荧光定量PCR及Westernblot等试验方法来验证STMN1基因对C2C12细胞的增殖分化功能的影响。研究结果如下:
　　1.利用生物信息学的方法对猪STMN1基因结构进行分析，预测得到猪STMN1基因近端启动子区域位于+817bp至+1066bp处，同时预测得到猪STMN1基因近端启动子区域具有MyoD、GATA-1、HSF2等转录因子结合位点和1个大小1000bp左右的CpG岛。对不同物种STMN1基因表达的蛋白序列比对，发现Stathmin蛋白具有高度保守性。
　　2.扩增通城猪、梅山猪、屯昌猪、杜洛克猪、大白猪、长白猪的STMN1基因的启动子及3'UTR区域，将扩增产物测序后用DNAMAN软件比对序列。发现在不同猪种中STMN1基因启动子区域的序列一致性很高，在启动子上游319bp、853bp、993bp、1161bp、1593bp、1859bp、1942bp、2154bp、2400bp处分别有T/C、A/G、A/G、A/G、C/T、C/T、C/G、C/T、C/T转换突变，可以将这些突变确定为启动子的潜在SNPs，同时在3'UTR区域也检测到14处潜在SNPs。
　　3.通过克隆猪STMN1基因的CDS后成功构建过表达STMN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-STMN1;成功设计并合成了干扰STMN1基因的干扰小片段siRNA-STMN1，分别转染C2C12细胞来上调/下调STMN1基因的表达量。
　　4.运用荧光定量PCR的方法检测了上调/下调STMN1基因表达后对C2C12细胞中与肌肉发育相关基因MyoD、MyoG、Myf5、MyHC的相对表达量。结果显示上调STMN1基因表达后，C2C12细胞中与肌肉发育相关的基因表达量都上调;下调STMN1基因表达后，C2C12细胞中与肌肉发育相关的基因表达量都下调。利用统计学软件SPSS对基因表达量进行分析，发现STMN1基因表达量的变化对C2C12细胞中与肌肉发育相关基因表达量的影响差异不显著(P＞0.05)。说明STMN1基因参与肌肉的分化，但是不是影响肌肉分化中的关键基因，需要进一步研究。
　　5.应用罗氏ARCE仪器对上调/下调STMN1基因表达后的C2C12细胞数量实时检测，结果显示STMN1基因表达量的变化对C2C12细胞数目有明显影响。使用统计学软件SPSS对测得数据分析，发现STMN1对C2C12细胞的增殖效果差异极显著(P＜0.01);同时用Westernblot的方法检测细胞增殖标志基因Ki67的表达量，检测结果与罗氏ARCE检测的结果一致。可以推测STMN1基因在细胞的增殖中起着重要作用。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 肌肉的生长发育

1．1．1 肌细胞发育相关的基因

1．1．2 肌细胞生长相关研究进展

1．2 STMN1基因概述及其功能研究

1．2．1 STMN1基因的结构

1．2．2 STMN1基因与细胞周期

1．2．3 STMN1基因的功能

1．3 研究目的与意义

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 试验样品与细胞及载体

2．1．2 主要试剂与试剂盒

2．1．3 主要试剂和缓冲液配制

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 分子生物学软件与生物信息学网站

2．2 试验方法

2．2．1 猪STMN1基因近端启动子生物信息学分析

2．2．2 猪STMN1基因的克隆及SNPs寻找

2．2．3 真核表达载体pcDNA3．1-STMN1的构建

2．2．4 干扰片段的设计与合成

2．2．5 细胞分化实验

2．2．6 细胞增殖实验

2．2．7 Western Blot检测STMN1基因对C2C12细胞影响后Ki67蛋白的表达量

2．2．8 统计分析方法

3 结果与分析

3．1 生物信息学分析STMN1基因

3．1．1 生物信息学对STMN1基因近端启动子区域预测

3．1．2 生物信息学对STMN1基因近端启动子区域CpG岛预测

3．1．3 生物信息学分析STMN1基因在不同物种中的亲缘关系

3．2 对猪STMN1基因启动子和3’UTR区域的克隆及SNPs寻找

3．2．1 克隆不同猪种STMN1基因启动子区域

3．2．2 克隆不同猪种STMN1基因3’UTR区域

3．2．3 对不同猪种STMN1基因的启动子及3’UTR区域的SNPs寻找

3．3 真核表达载体pcDNA3．1-STMN1的构建与干扰片段的合成

3．3．1 猪肌肉组织RNA的提取

3．3．2 猪STMN1基因的CDS扩增及真核表达载体pcDNA3．1-STMN1双酶切鉴定

3．3．3 干扰片段siRNA的筛选

3．4 猪STMN1基因对C2C12细胞的分化作用

3．4．1 C2C12细胞不同时期的分化效果

3．4．2 C2C12细胞的转染效率分析

3．4．3 猪STMN1基因对C2C12细胞分化的影响

3．5 猪STMN1基因对C2C12细胞增殖的影响

3．5．1 罗氏ARCE仪器实时检测上调／下调STMN1基因表达后C2C12细胞数目

3．5．2 上调／下调STMN1基因对细胞增殖影响数据分析结果

3．5．3 Western blot检测上调／下调STMN1基因的表达对C2C12细胞增殖的影响

4 讨论

4．1 实验设计

4．2 试验方法

4．2．1 细胞转染方法的选择与改进

4．2．2 实验仪器的选择

4．3 猪STMN1基因启动子区域潜在SNPs的可靠性

4．4 转染后的效果分析

4．5 猪STMN1基因对C2C12细胞分化的作用

4．6 猪STMN1基因对C2C12细胞增殖的影响

4．7 后续的工作计划

结论

参考文献

附录一

附录二

致谢