酸碱法提取鳙鱼蛋白及鱼糜凝胶品质的研究

摘要

鱼糜及鱼糜制品的加工是我国淡水鱼加工的一个重要发展方向。目前，多采用水洗法生产鱼糜，虽然取得了不错的成果，但是也暴露出了一些亟待解决的问题:劳动强度大，用水量大，鱼糜得率较低，同时会产生大量高固形物含量、高氮量和高化学需氧量的废水。国内外大量研究表明，酸碱法可用于鱼糜的生产，该方法不但能提高原料的利用率和鱼糜得率，而且能降低劳动强度和企业生产成本，生产出较高品质的鱼糜和鱼糜凝胶。但是，目前国外的研究多集中于海鱼或国外常见鱼种，而对淡水鱼的研究相对较少;国内虽然已有使用酸碱法生产鱼糜的报道，但是仅限于白鲢鱼和草鱼等少数淡水鱼种，对另一种低值淡水鱼——鳙鱼的研究尚未报道。因此，本研究拟选用酸碱法生产鳙鱼糜，旨在探讨酸碱法生产鳙鱼糜的可行性，并研究酸碱法对鳙鱼糜凝胶品质的影响及机理，以期为鳙鱼糜附加值的提高，鳙鱼加工产业链的延长以及淡水鱼糜生产新技术的创建以及新型鱼糜制品的开发提供理论基础。主要研究结果如下:
　　1.对水洗法和酸碱法生产鳙鱼糜的基本指标进行了测定，并对这三种鱼糜生产方法进行了比较。结果表明，鱼肉经三种不同方式处理后，灰分和粗脂肪含量显著降低(P＜0.05)，粗蛋白含量显著升高(P＜0.05)。鳙鱼肌肉蛋白的最大可溶性pH值为3.0和12.0，其等电点为5.5。酸碱法获得的鱼糜蛋白得率和脂肪去除率显著高于水洗法(P＜0.05)。在耗水量方面，酸碱法每生产1 kg鱼糜的耗水量显著低于水洗法(P＜0.05)。与鱼肉相比，三种处理所得到的鱼糜中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量显著降低(P＜0.05)。其中，酸碱鱼糜中这两种蛋白含量下降尤为显著(P＜0.05)。
　　2.对水洗和酸碱法生产的鱼糜凝胶的品质进行了评价。研究发现，水洗鱼糜凝胶表现出较高的凝胶强度和破断距离(P＜0.05)，碱法鱼糜凝胶的破断力为最高(P＜0.05)，酸法鱼糜凝胶的凝胶强度、破断力和破断距离皆为最低(P＜0.05)。质构分析结果表明，水洗鱼糜凝胶表现出较高的硬度和咀嚼性(P＜0.05)，而碱法鱼糜凝胶的粘结性较高（P＜0.05），酸法鱼糜凝胶在硬度、咀嚼性和粘结性上皆为最低（P＜0.05），三种鱼糜凝胶的弹性没有显著性差异(P＞0.05)。在色度方面，水洗鱼糜凝胶呈现出较高的亮度值（L*）和白度值(Whiteness)（P＜0.05）;由于红度值（a*）和黄度值(b*)较高(P＜0.05)，酸碱鱼糜凝胶的亮度值（L*）和白度值(Whiteness)低于水洗鱼糜凝胶(P＜0.05)。其次，水洗鱼糜凝胶的持水性为最高(P＜0.05)，酸法鱼糜凝胶的持水性为最低(P＜0.05)。通过扫描电镜(SEM)可以观察到，与水洗鱼糜凝胶相比，酸法鱼糜凝胶的网络孔径较大，结构更为粗糙、无序。水洗鱼糜凝胶的折叠评分值显著高于酸碱鱼糜凝胶(P＜0.05);其中，酸法鱼糜凝胶的折叠评分值为最低。此外，酸碱鱼糜呈现出与水洗鱼糜截然不同的动态流变学特性，并且酸碱鱼糜二者相比也各不相同。
　　3.对水洗和酸碱处理后鳙鱼肉蛋白的结构变化进行了研究。研究发现，经酸碱处理后，鳙鱼肉肌动球蛋白的Ca2+-ATP酶活性显著降低(P＜0.05)。与水洗鱼糜相比，酸碱鱼糜肌球蛋白的圆二色谱图(CD)发生了变化，肌球蛋白中α-螺旋含量显著下降(P＜0.05)。十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明，酸碱鱼糜中（特别是酸法鱼糜）肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白(Actin)这两条带的浓度明显低于鱼肉和水洗鱼糜，这表明这两条蛋白带经过酸碱处理后发生了降解;此外，在鱼糜凝胶的条带中，MHC的量下降明显，而actin的变化较小。水洗鳙鱼糜的差示扫描量热(DSC)曲线在35℃和67℃左右出现两个吸收峰，而酸碱鱼糜没有吸收峰的出现。最后，与水洗鱼糜相比，酸碱鱼糜的表面疏水性显著升高(P＜0.05)。化学作用力的研究结果表明，疏水相互作用和二硫键在鳙鱼糜凝胶形成过程中发挥了重要的作用。通过归纳总结以上的研究结果可以推测，鳙鱼肌球蛋白经过酸碱处理后发生了变性进而相互聚集，从而导致酸碱鳙鱼糜凝胶特性的下降。
　　4.使用蛋白质组学对水洗和酸碱处理后鳙鱼肌肉蛋白的变化进行了进一步研究。研究结果如下:对鳙鱼肉蛋白及水洗法和酸碱法生产的鳙鱼糜蛋白进行双向凝胶电泳(2-DE)分离，经染色后皆获得了清晰度及分辨率较高的2-DE图谱。在对三种鳙鱼糜2-DE图谱的比较分析后，筛选得到具有统计学意义和显著变化的蛋白点102个。质谱分析共获得71个蛋白点的鉴定结果。所涉及的差异蛋白多来自细胞质、细胞骨架和肌球蛋白复合体，并且可分为具有结合作用的蛋白和参与酶活动的蛋白两类，这些蛋白多参与了生物体的代谢过程、磷酸化作用、糖酵解作用和氧化还原过程。与鱼肉和酸碱鱼糜的2-DE凝胶图谱相比，水洗法导致蛋白量下降的蛋白点多为酶类。其中包括丙酮酸激酶、烯醇酶1、磷酸化酶、肌酸激酶M2等。在肌肉组织和蛋白结构方面，共有14个蛋白点发生了变化:水洗法会导致快骨骼肌类型3 MHC和α-辅肌动蛋白3b蛋白量的下降。酸碱法造成蛋白量下降的点分别为低温型轻酶解肌球蛋白和结蛋白。与鱼肉和酸碱鱼糜的2-DE凝胶图谱相比，水洗鱼糜的2-DE凝胶图谱中蛋白量升高的蛋白点有快骨骼肌类型1 MHC、肌球蛋白低温型S1重链、原肌球蛋白α-1链。与鱼肉和水洗鱼糜的2-DE凝胶图谱相比，酸碱鱼糜的2-DE凝胶图谱中蛋白量升高的蛋白点分别为Sk-原肌球调节蛋白和肌球蛋白调节性轻链。其中，酸法处理可导致快骨骼肌类型3 MHC蛋白量上升;而碱法会导致10C轻酶解肌球蛋白和快骨骼肌类型1 MHC蛋白量上升。
　　5.对水洗和酸碱鳙鱼糜在反复冻融情况下凝胶品质的变化进行了研究。结果表明，随着冻融次数的增加，三种鱼糜凝胶的破断力、破断距离和凝胶强度都呈下降趋势;此外，鱼糜凝胶的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性也呈下降趋势。反复冻融会使鱼糜凝胶的持水性降低，蒸煮损失升高。反复冻融在降低鱼糜凝胶亮度的同时，提高凝胶的红度和黄度，因此造成鱼糜凝胶的白度下降。最后，随着冻融次数的增加，三种鱼糜凝胶的折叠试验评分均呈下降趋势。最后，本研究对反复冻融后鳙鱼糜物化特性和蛋白结构的变化进行了研究。结果显示，过多的冷冻-解冻过程会对鳙鱼糜的物化特性和蛋白结构变化产生不利的影响。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1 选题的背景和目的

1．1 鳙鱼的简介

1．2 淡水鱼加工状况

1．3 鱼糜及鱼糜制品

1．4 鱼糜的生产方法

1．5 酸碱法对鱼糜品质的影响

1．6 差异蛋白质组学

2 研究内容与研究意义

2．1 研究内容

2．2 技术路线

2．3 研究意义

第二章 鳙鱼糜基本指标的测定

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 鳙鱼肌肉和鱼糜基本成分的测定

2．2 不同pH值条件下鳙鱼肌肉蛋白溶解度的测定

2．3 水洗鳙鱼糜的制备

2．4 酸碱鳙鱼糜的制备

2．5 蛋白得率和脂肪去除率的测定

2．6 鱼糜生产耗水量的测定

2．7 水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的测定

2．8 数据处理与统计分析

3 结果与讨论

3．1 鳙鱼肌肉和鱼糜基本成分的测定

3．2 鳙鱼肉蛋白最大溶解度pH值和等电点的确定

3．3 蛋白得率和脂肪去除率的测定

3．4 鱼糜生产耗水量的测定

3．5 水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量

4 本章小结

第三章 酸碱鳙鱼糜凝胶品质的评价

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 水洗鳙鱼糜的制备

2．2 酸碱鳙鱼糜的制备

2．3 鱼糜凝胶的制备

2．4 凝胶穿剌试验

2．5 鱼糜凝胶质构分析

2．6 鱼糜凝胶色度的测定

2．7 鱼糜凝胶持水性的测定

2．8 鱼糜凝胶微观结构的观察

2．9 鱼糜凝胶折叠试验

2．10 流变学特性的研究

2．11 数据处理与统计分析

3 结果与讨论

3．1 鱼糜凝胶强度

3．2 鱼糜凝胶的质构特性

3．3 鱼糜凝胶的白度

3．4 鱼糜凝胶的持水性

3．5 鱼糜凝胶的微观结构

3．6 鱼糜凝胶折叠试验

3．7 鱼糜流变学性质的研究

4 本章小结

第四章 酸碱处理对鳙鱼肌动球蛋白的影响

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 水洗鳙鱼糜的制备

2．2 酸碱鳙鱼糜的制备

2．3 鱼糜凝胶的制作

2．4 肌动球蛋白溶液的制备

2．5 蛋白表面疏水性的测定

2．6 蛋白总巯基含量的测定

2．7 Ca2+-ATP酶活性的测定

2．8 化学作用力的测定

2．9 鱼糜蛋白圆二色谱(CD)的测定

2．10 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．11 热特性的测定

2．12 数据处理与统计分析

3 结果与讨论

3．1 Ca2+-ATP酶活性的变化

3．2 鱼糜肌球蛋白α-螺旋结构的变化

3．3 SDS-PAGE

3．4 热力学特性的变化

3．5 酸碱处理对蛋白表面疏水性的影响

3．6 总巯基含量的变化

3．7 鱼糜及鱼糜凝胶中氢键、静电相互作用和疏水相互作用的变化

3．8 酸碱鳙鱼糜凝胶形成机理

4 本章小结

第五章 酸碱鱼糜差异蛋白质组学的研究

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器与设备

1．3 试剂配制

2 试验方法

2．1 水洗鱼糜的制备

2．2 酸碱鳙鱼糜的制备

2．3 样品的预处理

2．4 蛋白质的提取及纯化

2．5 一维等电聚焦(IEF)

2．6 SDS-PAGE电泳

2．7 凝胶染色

2．8 凝胶扫描以及图像分析

2．9 差异蛋白质点的鉴定

2．10 质谱分析和数据库检索

2．11 差异蛋白的生物信息学分析

3 结果与讨论

3．1 三种鳙鱼糜蛋白的2-DE图谱

3．2 三种鳙鱼糜2-DE图谱的比较分析

3．3 鱼糜生产过程中差异蛋白质的质谱鉴定与分析

3．4 差异蛋白的生物信息学分析

3．5 与鳙鱼肌肉组织构造和肌肉蛋白结构有关的蛋白

4 本章小结

第六章 反复冻融对鳙鱼糜凝胶性质的影响

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 水洗鳙鱼糜的制备

2．2 酸碱鳙鱼糜的制备

2．3 鱼糜凝胶的冻融试验

2．4 鱼糜凝胶的制作

2．5 凝胶穿刺试验

2．6 鱼糜凝胶质构分析

2．7 鱼糜凝胶色度的测定

2．8 鱼糜凝胶持水性的测定

2．9 鱼糜蒸煮损失的测定

2．10 折叠试验

2．11 数据处理与统计分析

3 结果与讨论

3．1 反复冻融对鱼糜凝胶强度的影响

3．2 反复冻融对鱼糜凝胶质构特性的影响

3．3 反复冻融对鱼糜凝胶持水性的影响

3．4 反复冻融对鱼糜凝胶色度的影响

3．5 反复冻融对鱼糜凝胶蒸煮损失的影响

3．6 反复冻融对鱼糜凝胶折叠试验的影响

4 本章小结

第七章 反复冻融对鳙鱼糜肌动球蛋白结构的影响

1 材料与仪器设备

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 水洗鱼糜的制备

2．2 酸碱鳙鱼糜的制备

2．3 鱼糜凝胶的冻融试验

2．4 肌动球蛋白溶液的制备

2．5 鱼糜盐溶性蛋白含量的测定

2．6 鱼糜Ca2+-ATP酶活性的测定

2．7 鱼糜羰基含量的测定

2．8 鱼糜表面疏水性的测定

2．9 鱼糜总巯基含量的测定

2．10 鱼糜TBARS值的测定

2．11 数据处理与统计分析

3 结果与讨论

3．1 反复冻融对鳙鱼糜Ca2+-ATP酶活性的影响

3．2 反复冻融对鱼糜中盐溶性蛋白的影响

3．3 反复冻融对鱼糜表面疏水性的影响

3．4 反复冻融对鱼糜总巯基含量的影响

3．5 反复冻融对鱼糜中TBARS值的影响

3．6 反复冻融对鱼糜羰基含量的影响

4 本章小结

第八章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间的研究成果