EPA和DHA调控CacO-2细胞乳糜微粒组装的机制研究

摘要

日粮脂类中的长链脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）在进入机体前必须在被肠上皮细胞吸收摄取后，经历一系列转运及组装过程，最终以乳糜微粒(Chylomicron，CM)的形式分泌进入循环系统。为了阐明动物肠上皮细胞转运日粮中不同种类LCFA的差异，本研究利用Caco-2细胞建立体外肠上皮细胞模型，从单层细胞膜结构的完整性以及酶/功能性蛋白表达两个方面评价模型的有效性;在此基础上研究n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA)对Caco-2细胞CM合成及分泌的影响，通过放射性同位素标记技术监测CM合成过程中两个重要底物（甘油三酯和载脂蛋白B）的合成情况，解释在Caco-2细胞合成及分泌CM的过程中观察到的不同脂肪酸的差异性;考虑到肝型脂肪酸结合蛋白(Liver fatty acidbinding protein，L-FABP)可以携带LCFA入核调控基因表达，在揭示了脂肪酸处理与L-FABP表达量的关系后，构建了L-FABP过表达载体并筛选出了有效抑制L-FABP表达的干扰序列，为后续机制研究奠定基础。
　　1.Caco-2单层细胞模型的建立。利用电阻仪测定跨上皮细胞电阻(Transepithelialelectrical resistance，TEER)评价单层膜结构的完整性和致密性，TEER值随着培养时间的延长呈现稳定的上升趋势，分化20d时TEER值平均可以达到570Ω·cm2;功能性结构的形成通过透射电镜进行确认，分化21d的Caco-2细胞具有微绒毛及紧密连接这两个很具有代表性的肠上皮细胞特有的超微结构;碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)作为极性分泌的刷状缘酶可以反应Caco-2细胞的分化进程，培养21d时，ALP几乎全部集中在顶端刷状缘一侧;L-FABP作为脂质代谢关键蛋白，其表达量可以反应脂质代谢等生理功能是否完善，随着分化的进行Caco-2细胞内L-FABP表达量逐渐增加，在分化成熟的Caco-2细胞中L-FABP表达量很高。
　　2.DHA(Docosahexaenoic acid,22∶6)及EPA(eicosapentaenoic acid,20∶5)对Caco-2细胞CM组装分泌的影响。MTT试验分析脂肪酸浓度对Caco-2细胞的脂质毒性发现，600μmol/L浓度OA(Oleic acid，18∶1)处理下细胞的存活力仍然可以达到95％;往上室培养基中加入[1，2，3-3H]glycerol研究TG合成情况，相比对照组，400μmol/L浓度的脂肪酸处理均可以显著增加胞内聚集的及培养基中分泌的[3H]triglyceride的量(P＜0.01)，标记的TG的量随着孵育时间的延长而增加，直到36h时，脂肪酸对TG合成的差异性才显现出来，相比OA处理组，EPA处理组细胞内聚集的以及培养基中分泌的[3H]triglyceride的量分别降低了16.5％和21％，DHA处理组则分别降低了23.2％和28％(P＜0.01);向上室培养基中加入[1-14C]脂肪酸检测细胞对不同脂肪酸的摄取效率，上室培养基中放射性元素的消失率及摄取进入细胞的放射性元素的强度都相同(P＞0.05)，在处理12h～24h间约有50％～80％的脂肪酸进入细胞内，下室培养基中放射性元素的强度在三种脂肪酸处理间也没有差异(P＞0.05);向上室培养基中加入[35S]methionine检测载脂蛋白B(Apolipoprotein B，apoB)的合成情况，三种脂肪酸处理下，不管是胞内聚集的还是培养基中分泌的被标记的apoB48及apoB100的量都显著增加(P＜0.01)，EPA和DHA处理组显著低于OA处理组(P＜0.01)，EPA和DHA处理组之间差异不显著(P＞0.05);利用密度梯度离心分离测定脂蛋白发现，相比相同浓度的OA，400μmol/L的EPA和DHA可以显著降低Caco-2细胞CM的分泌量（P＜0.01）。
　　3.脂肪酸处理与L-FABP表达量之间关系的确定及L-FABP过表达/干扰质粒的构建筛选。400μmol/L的OA、EPA和DHA刺激36h均显著增加了Caco-2细胞内L-FABP的表达量(P＜0.01)，三种脂肪酸在刺激L-FABP表达的效果上没有差异(P＞0.05);设计的4条shRNA干扰载体分别与测序正确的过表达载体共转染293T细胞，利用western检测L-FABP的表达，验证了过表达质粒可以有效翻译形成L-FABP，设计的干扰序列中shRNA2载体的干扰效率最高;转染Caco-2细胞，干扰组L-FABP的表达量显著低于干扰对照组(P＜0.01)，过表达组L-FABP的表达量显著高于过表达对照组（P＜0.01）。为后续探究脂肪酸对CM组装分泌的影响是否依赖于L-FABP/PPARα信号通路奠定基础。
　　以上结果表明:本试验条件下极性分化完全的Caco-2细胞可以作为研究小肠营养物质吸收代谢的体外模型，用于后续脂质代谢的相关试验;相比OA，EPA和DHA抑制Caco-2细胞CM分泌的作用并非由于脂肪酸摄取的差异造成，而是受TG及apoB合成减少的影响。阐明了日粮中不同LCFA对动物肠上皮细胞内CM组装分泌的影响及分子机制，完善动物肠上皮细胞转运日粮脂肪的基础理论。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

1 前言

2 脂肪酸在消化吸收过程中的特异性

2．1 肠道对不同脂肪酸的吸收存在差异

2．2 不同脂肪酸对脂蛋白合成的影响

3 肠上皮细胞内乳糜微粒的组装和分泌

3．1 乳糜微粒组装及分泌过程

3．2 肠上皮细胞内参与CM组装分泌的关键蛋白

4 肝型脂肪酸结合蛋白研究进展

4．1 小肠内共表达的两种脂肪酸结合蛋白亚型

4．2 肝型脂肪酸结合蛋白的生理功能

5 Caco-2细胞肠道脂质代谢模型的特点

5．1 培养条件的重要性

5．2 形态结构及功能

5．3 模型的局限性

6 研究的目的意义

第二部分 试验材料与方法

1 材料及仪器

1．1 细胞系及质粒

1．2 药品及试剂

1．3 主要溶液及其配制

1．4 仪器及设备

2 试验方法

2．1 细胞复苏

2．2 细胞传代

2．3 细胞冻存

2．4 肠上皮细胞模型的建立

2．5 肠上皮细胞模型的验证

2．6 MTT法测定脂肪酸处理对细胞活力的影响

2．7 甘油三酯的合成和分泌

2．8 乳糜微粒的分离及测定

2．9 从头合成载脂蛋白测定

2．10 蛋白含量测定

2．11 脂肪酸的摄取

2．12 过表达载体的构建

2．13 干扰质粒的构建

2．15 脂肪酸对L-FABP表达的调控作用

2．16 L-FABP表达质粒及干扰质粒分别转染Caco-2细胞

2．17 统计方法

第三部分 结果与讨论

第一章 Caco-2细胞模型的建立与验证

1 前言

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二章 n-3 PUFA对Caco-2细胞CM合成及分泌的影响

1 前言

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 L-FABP过表达质粒的构建及干扰质粒的筛选

1 前言

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四部分 结语

1 成果与结论

2 创新点

3 不足与展望

参考文献

附录

研究生在读期间发表学术论文

致谢