蜡梅花挥发物组分测定及芳樟醇合成酶启动子分析

摘要

蜡梅(Chimonanthus praecox L.)花香馥郁，是我国的十大传统名花。蜡梅花香味独特，花香成分在不同品种之间存在差异。本文以不同基因型的蜡梅H29、H64、H93、H36、SW001为研究材料，测定了盛花期蜡梅的主要香味成分。通过芳樟醇合成酶基因的表达量和芳樟醇物质释放量的对比，发现了蜡梅H64和H29在芳樟醇合成酶表达上的显著差异。克隆H29和H64的芳樟醇合成酶启动子，对比其序列。采用启动子5'缺失法，构建CpLISP-H64缺失表达载体，利用拟南芥原生质体验证了缺失启动子的表达情况。本实验主要获得以下结果:
　　1.测定了5种蜡梅基因型的盛花期挥发物成分，鉴定得到86种化合物。并通过定量分析，研究了不同品种的主要挥发物质差异，得出H93盛花期挥发物质总量最高，主要成分是芳樟醇和乙酸苄脂;H64次之，主要挥发成分相同，H36的主要挥发物质是芳樟醇，其次是β-罗勒烯，而蜡梅SW001中β-罗勒烯含量最高且没有检测到芳樟醇。
　　2.对SW001不同时期的花香成分进行测定，鉴定得到60种化合物。通过定量分析，得出SW001的主要化合物质是β-罗勒烯，1-石竹烯，水杨酸甲酯，和苯甲醇。各个阶段均没有检测到其它基因型中含量较多的芳樟醇和乙酸苄酯。主要物质的挥发规律均为，蕾期到初开期释放缓慢，盛开期达到顶峰，末花期下降。
　　3.H29和H64芳樟醇的释放量与其芳樟醇合成酶的表达量规律相同，差异显著。克隆二者的芳樟醇合成酶启动子，比较得到1106bp中仅有3个碱基位点的差异。表明芳樟醇启动子的结构差异不是芳樟醇释放的调控的关键因素。
　　4.分析CpLISP-H64结构，预测得到跟光、激素以及非生物胁迫相关的顺式作用元件。通过5'缺失构建5段长短不同的启动子序列的表达载体，在拟南芥原生质体中表达。得到LISP4-PBI121与LISP5-PBI121之间的序列，即翻译起始位点前750bp-1006bp为主要功能区。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 蜡梅介绍

1．2 文献综述

1．2．1 花香成分分析

1．2．2 萜烯类花香基因工程

1．2．3 课题概述

2．蜡梅花香测定

2．1 研究材料与试剂

2．2 研究方法

2．2．1 不同蜡梅株系盛开期的花香成分分析

2．2．2 测定SW001不同时期的花香成分分析

2．2．3 内标溶液准备

2．2．4 HS-SPME取样

2．2．5 GC-MS分析

2．2．6 数据分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 不同蜡梅株系盛花期成分定量分析比较

2．3．2 SW001不同时期花香成分分析

2．3．3 蜡梅特征香气成分初步分析

2．4 讨论

3．蜡梅芳樟醇合成酶启动子克隆与序列分析

3．1 前言

3．2 研究材料与试剂

3．3 研究方法

3．3．1 素心蜡梅H64DNA的提取

3．3．2 素心蜡梅H64 LINS启动子的克隆

3．4 结果与分析

3．4．1 素心蜡梅H64芳樟醇合成酶启动子的获得

3．4．2 芳樟醇合成酶启动子与芳樟醇合成酶基因序列的对比分析

3．4．3 H64LINS启动子序列分析

3．5 讨论

4．不同基因型蜡梅芳樟醇合成酶启动子克隆与序列对比

4．1 研究材料与试剂

4．2 研究方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

5．蜡梅启动子缺失载体构建及功能验证初步

5．1 研究材料与试剂

5．1．1 蜡梅LINS启动子序列缺失表达载体构建

5．1．2 大量法提取载体质粒

5．1．3 原生质体的提取和转化

5．1．4 原生质体GUS提取和活性测定

5．1．5 原生质体蛋白含量测定

5．2 结果与分析

5．2．1 启动子缺失表达载体构建

5．2．2 原生质体制备

5．2．3 原生质体GUS活性测定

6．分析与讨论

参考文献

致谢