禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗候选抗原的免疫原性研究

摘要

由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenicEscherichia coli,APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病统称为大肠杆菌病，其主要引起大肠杆菌性败血症、大肠杆菌性肉芽肿、气囊病、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、卵黄囊感染、输卵管炎、滑膜炎等。目前，由于抗生素的大量不合理使用，禽致病性大肠杆菌的耐药菌株越来越多，使得药物治疗面临极大的困难。因此，研制出一种具有交叉保护力的疫苗十分重要。IutA蛋白、IroN蛋白和GroEL蛋白广泛存在于禽致病性大肠杆菌菌株中，尤其是强毒菌株。本研究以禽致病性大肠杆菌为研究对象，将IutA蛋白、IroN蛋白和GroEL蛋白作为亚单位疫苗的一种候选抗原，开发一种具有广泛保护性的疫苗。
　　巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统。与其他表达系统相比，具有易于培养，繁殖快，适合高密度发酵及不产生有毒物质等优点。本研究利用毕赤酵母表达系统高效表达IutA蛋白、IroN蛋白和GroEL蛋白，其主要工作如下：
　　1.重组巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris）工程菌株的构建及表达
　　以ACN001菌株基因组为模板将iutA基因、iroN基因、groEL基因克隆入pPICZαA表达质粒，获得重组表达质粒pPICZαA-iutA、pPICZαA-iroN和pPICZαA-groEL，将构建好的表达质粒电击转化入毕赤酵母感受态GS115细胞中。通过博来霉素筛选高表达的pPICZαA-iutA/GS115、pPICZαA-iroN/GS115和pPICZαA-groEL/GS115的工程菌株并进行诱导表达。
　　2.三组分重组亚单位疫苗的制备
　　使用BCA试剂盒测定镍柱纯化后的重组蛋白的浓度，将三种蛋白以一定的比例混合（疫苗中的每种重组蛋白按剂量以50μg混匀），用佐剂进行乳化蛋白，配制成禽致病性大肠杆菌三组分亚单位疫苗。
　　3.交叉免疫保护实验
　　小鼠免疫实验表明，以 ACN001（O78）、A008（O2）、2943（O1）分别对免疫小鼠进行攻毒。结果显示：三组分亚单位疫苗对禽致病性大肠杆菌 ACN001（O78）、A008（O2）、2943（O1）攻毒后的免疫保护率分别为73％，66.67%，66.67%。

目录

声明

缩略语表(Abbreviation)

1文献综述

1.1禽致病性大肠杆菌的概述

1.2禽致病性大肠杆菌的血清型

1.3禽致病性大肠杆菌的毒力因子

1.4亚单位疫苗概述

1.5毕赤酵母表达系统概述

2目的与意义

3.1实验材料

3.2实验方法

4结果与分析

4.1重组质粒的构建

4.2电转化构建重组酵母菌株及重组子的筛选鉴定

4.3重组IutA、IroN、GroEL蛋白的表达检测

4.4小鼠保护性实验结果分析

5讨论

5.1表达系统的优化

5.2毕赤酵母重组子PCR模板的制备方法

5.3免疫佐剂的影响

5.4基因的选择

5.5三组分亚单位疫苗免疫效果的评估

6结论

参考文献

致谢