中国马铃薯S病毒安第斯和普通株系的Rt-PCR分型及分子和病理学鉴定

摘要

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物，中国是世界最大的马铃薯种植和生产国，但是各种马铃薯病毒病一直严重制约着马铃薯产业的发展。马铃薯S病毒(Potato virus S, PVS)是世界范围的侵染马铃薯的常见病毒之一，在对我国湖北地区马铃薯进行病毒检测中发现，PVS是发生频率最高的病毒，因此本研究开展了对PVS分子和病理学特征的分析。
　　本研究根据已报道的PVS全长基因组序列，以PVS外壳蛋白(CP)和ORF1为目标区域，分别设计了株系特异引物，用以鉴别PVS两个典型的株系——普通株系和安第斯株系(即PVSO和PVSA)。以这些株系特异性引物进行RT-PCR分析，可以成功的区分PVSO和PVSA两种株系。通过对这些引物的PCR扩增产物测序比对分析，证实了这些引物的特异性和PCR分型结果的准确性。在上述RT-PCR方法鉴定获得的PVSO和PVSA株系分离物中各挑选一个典型的代表，分别命名为PVSHB24和PVSHB7，用于后续分子及生物学特征的鉴定。经过克隆和测序，获得了PVS HB24和HB7两个代表分离物8，453 bp的全长基因组序列，它们均含有6个开放阅读框，两个株系分离物的全长基因组序列核苷酸同源性为79.5％。基于全长基因组序列和CP基因的聚类分析均显示PVS HB24和PVS HB7分别聚类于PVSO和PVSA分支，属于这两种株系的典型代表。将两个分离物通过机械伤害分别接种藜麦（Chenopodium quinoa），PVS HB24会引起接种叶局部失绿坏死症状，但在植株的上部非接种叶无明显症状;而PVS HB7既可以诱导接种叶出现局部失绿坏死，在非接种叶也可以导致花叶症状。ELISA和RT-PCR检测也证明PVS HB7可以系统侵染藜麦，而PVS HB24则不能。将两分离物接种其他茄科寄主植物发现，它们都能侵染野生马铃薯Solanum chacoense和栽培马铃薯Solanum tuberosum cv.Shepody，并且均不表现明显症状;但两个分离物都不能侵染烟草Nicotiana occidentalis和N.tobaccum cv.Samsun。
　　本研究首次报道了中国PVS病毒的株系状况，克隆了第一个中国PVSA株系分离物，并分析鉴定了其分子和病理特性。同时，本研究建立了以PCR为基础的PVS分型体系，为PVS的株系分型鉴定提供新的技术手段，与生物学（指示植物）和血清学的方法相比，该方法大大减少了分析时间，提高了分型鉴定的准确性。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 文献综述

1．2．1 马铃薯主要病毒病

1．2．2 马铃薯S病毒研究进展

I．2．3 PVS多样性及分类依据

1．2．4 PVS基因组结构

1．2．5 马铃薯PVS抗性研究

1．2．6 马铃薯病毒株系的鉴定方法

1．3 研究目的、内容与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料保存

2．1．2 试剂及仪器

2．2 实验方法

2．2．1 核酸抽提及cDNA的制备

2．2．2 PVS分型检测体系的建立

2．2．3 PVS全长基因组克隆

2．2．4 PVS指示植物机械接种与检测

3 结果与分析

3．1 田间马铃薯感病情况

3．2 PVS株系分型鉴定

3．2．1 PVS株系分型引物设计

3．2．2 PVS株系分型体系的验证

3．2．3 扩增子测序验证

3．3 PVS湖北分离物的克隆

3．3．1 PVS HB7和HB24的克隆与测序

3．3．2 PVS HB7和HB24的基因组结构及序列同源性比对

3．3．3 PVS HB7和HB24与其它全长序列的同源性比对

3．3．4 PVS HB7和HB24的系统进化分析

3．4 PVS湖北分离物致病性分析

3．4．1 PVS湖北分离物对指示寄主的致病性

3．4．2 PVS分离物接种烟草及马铃薯

3．5 中国部分马铃薯产区常见病毒发生情况调查

3．5．1 中国部分马铃薯产区常见6种病毒检测

3．5．2 中国部分马铃薯产区PVS多样性研究

4 讨论

4．1 PVS株系分型鉴别方法的发展

4．2 PVSA株系特征及重要性

4．3 中国部分马铃薯产区病毒发生情况调查

4．4 展望

参考文献

研究生期间发表文章

致谢