在转基因鼠模型中验证猪MyoG启动子驱动猪PPARγ基因的上调表达

摘要

在近几十年猪育种中，国内外的研究一直注重猪瘦肉率的提高而忽略肌肉品质。肌肉品质一般表现为肉质的嫩度、多汁性和口味，肌内脂肪的提高能够使肌肉的嫩度、多汁性得到提高。本实验室已经构建了调节肌内脂肪含量的肌肉特异性表达载体pGL3-MyoG-PPARγ-Flag-poly(A) Signal，主要包括猪肌肉特异性表达基因肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）的启动子和脂肪相关基因过氧化物酶体增殖激活受体γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorsγ，PPARγ），质粒的活性在C2C12细胞中得到验证后进行线性化处理，利用原核显微注射法成功制备MyoG-PPARγ转基因鼠。本试验以转基因鼠为模型，从MyoG-PPARγ转基因鼠的表型、DNA水平、mRNA水平、蛋白水平这几个方面验证组织特异性启动子MyoG对MyoG-PPARγ转基因小鼠的影响和MyoG启动子的活性。最终证明肌肉特异性启动子MyoG可以驱动外源PPARγ基因在活体水平上调表达。
　　主要研究结果如下:
　　1、分别对4只首建鼠进行繁殖、建系。首建♂1鼠得到了稳定遗传的后代，截止目前已传至F5代。首建♂1转基因小鼠阳性率已达到95％，达到建系的标准。
　　2、绘制小鼠1-12周龄的体重增长曲线，以及对3个阶段（1月龄、2月龄、3月龄）MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠血清中与脂肪相关的部分指标检测，研究结果表明:每个时间段MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠在体重增长方面没有显著性差异(p＞0.05);1月龄、2月龄MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠血清中的总胆固醇和甘油三酯均差异显著(p＜0.05)。所检测的每只鼠的指标均在FVB型鼠正常范围之内。这两项结果确定外源基因的插入并不影响转基因鼠的健康。
　　3、采用绝对定量PCR的技术，分析MyoG-PPARγ转基因鼠拷贝数，结果表明:首建♂1鼠的拷贝数是2.24，说明外源基因并不是单拷贝插入。通过对随机选择的F0-F5代转基因阳性鼠拷贝数的统计，发现随着繁殖代数的增加，MyoG-PPARγ转基因鼠后代外源基因拷贝数大多都增加，也有少部分降低。
　　4、采用qRT-PCR技术，测定1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠外源基因PPARγ以及其下游靶基因脂肪酸结合蛋白基因(Adipocyte Fatty AcidBinding Proteins，A-FABP）、脂蛋白脂肪酶基因（Lipoprotein Lipase，LPL）mRNA水平的表达量，发现MyoG-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠均有显著性升高(p＜0.05)。纵向比较1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠外源基因PPARγ的表达量，1月龄Myo G-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠外源基因PPARγ的表达量提升最多。
　　5、采用Western Blot、免疫组化技术检测外源基因PPARγ蛋白水平的变化，结果显示，MyoG-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠PPARγ蛋白表达量有所提高。
　　6、检测1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠进行腿肌中甘油三酯含量，发现整个生长阶段MyoG-PPARγ转基因鼠甘油三酯的表达量都显著高于FVB野生型鼠(p＜0.05)。随着小鼠的生长发育，小鼠脂肪沉积逐渐增加。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 引言

2 启动子简介

2．1 启动子的结构及分类

2．2 启动子的研究方法及克隆方法

3 转基因动物的研究进展

3．1 转基因动物的发展

3．2 转基因动物的制备方法

3．3 转基因动物的应用

3．4 转基因技术的难题

3．5 转基因动物的安全评价

3．6 转基因技术以及转基因动物的发展前景

4 MyoG及其启动子的研究进展

4．1 MyoG的研究进展

4．2 MyoG启动子的研究进展

5 PPARy的研究进展

6 研究目的和意义

第二章 材料方法

1 试验材料

1．1 质粒

1．2 试验动物

1．3 主要仪器与设备

1．4 主要试剂及试剂盒

1．5 主要溶液的配制

2 试验方法

2．1 后代MyoG-PPARγ阳性转基因鼠的建系及鉴定

2．2 MyoG-PPARγ转基因鼠基因组内拷贝数的鉴定

2．3 MyoG-PPARγ转基因鼠目的基因在RNA水平表达情况的验证

2．4 MyoG-PPARγ转基因鼠目的基因在蛋白水平表达情况的验证

2．5 MyoG-PPARγ转基因鼠肌肉组织免疫组化分析目的蛋白PPARγ的定位和表达情况

2．6 MyoG-PPARγ转基因鼠和野生型体重及血常规测定

2．7 MyoG-PPARγ转基因鼠肌肉组织甘油三酯的测定

2．8 统计学分析

第三章 MyoG-PPARγ转基因鼠研究结果与分析

1 MyoG-PPARγ转基因鼠建系及鉴定

1．1 MyoG-PPARγ转基因鼠的建系

1．2 MyoG-PPARγ转基因鼠的鉴定

2 MyoG-PPARγ转基因鼠遗传稳定性的鉴定

3 MyoG-PPARγ转基因鼠表型的鉴定

3．1 MyoG-PPARγ转基因鼠与FVB野生型鼠成长曲线

3．2 MyoG-PPARγ转基因鼠与FVB野生型鼠血液指标检测

4 外源基因在MyoG-PPARγ转基因鼠基因组内拷贝数的统计

4．1 绝对定量标准曲线的绘制

4．2 MyoG-PPARγ转基因鼠外源基因拷贝数的统计

5 MyoG-PPARγ转基因鼠与FVB野生型鼠腿肌中PPARγ基因及下游靶基因A-FABP和LPL的检测

5．1 利用实时荧光PCR技术检测PPARγ、A-FABP和LPL在mRNA水平的表达

5．2 利用Western Blot技术检测PPARγ在蛋白水平的表达

6 MyoG-PPARγ转基因鼠腿肌中PPARγ蛋白的定位

7 MyoG-PPARγ转基因鼠与FVB野生型鼠腿肌内甘油三酯的检测

第四章 讨论

1 MyoG-PPARγ转基因鼠表型的研究

2 MyoG-PPARγ转基因鼠DNA水平的研究

3 MyoG-PPARγ转基因鼠mRNA水平的研究

4 MyoG-PPARγ转基因鼠蛋白水平的研究

5 MyoG-PPARγ转基因鼠肌内脂肪含量的测定

6 MyoG-PPARγ转基因鼠个体差异分析

第五章 结论

1 本试验取得的结果

2 下一步计划

参考文献

致谢