喹赛多与其靶蛋白hnRNP A2/B1相互作用研究

摘要

喹赛多是喹噁啉类化合物饲料添加剂，兼有抑菌及促生长功效，且安全低毒、用药后迅速吸收及消除、残留期短、无蓄积，在畜牧生产中具有良好的应用潜力。本实验室通过连续亲和层析实验和生物质谱技术初步筛选出喹赛多在人正常肝细胞HL-7702（L-02）内的特异结合蛋白为核内不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1），并且用分子对接软件预测出它们之间的结合位点为Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)。但是喹赛多与hnRNP A2/B1的具体相互作用及它们结合后引起的生物学效应并没有得到确证和研究，而喹赛多与靶蛋白之间作用位点、亲和力的研究对于弄清楚其药理机制具有重要的意义。本课题将通过体外重组表达hnRNP A2/B1蛋白及其突变蛋白，进行表面等离子体共振实验(SPR)，研究喹赛多与hnRNP A2/B1之间的结合特性，并通过RNA干扰实验（RNAi）研究hnRNP A2/B1对喹赛多调节细胞内增殖相关基因表达的影响，分析喹赛多促生长的作用机理。
　　1.喹赛多与hnRNP A2/B1的相互作用
　　针对分子对接中预测的喹赛多与hnRNP A2/B1的3个结合位点，Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)，根据氨基酸定点突变原则分别将其突变为Ala(101)、Ala(102)和Gly(105)。构建原核表达质粒pET28a-hnRNP A2/B1、Lys101Ala、Arg102Ala、Ala105Gly，通过大肠杆菌体外大量表达目的蛋白，利用His-tag亲和Ni柱纯化目的蛋白并用Western blot技术验证后，与喹赛多进行SPR实验。通过多循环方法检测到喹赛多与hnRNP A2/B1及突变蛋白R(R101A)和A(A102G)都能结合，具有浓度依赖性。同时喹赛多与野生型hnRNP A2/B1的亲和力要强于突变蛋白，因此Arg(102)对其结合有一定的影响，而对Lys(101)进行突变后蛋白与喹赛多完全失去相互作用，说明Lys(101)直接参与了喹赛多与hnRNP A2/B1的结合，是一个关键的结合位点。
　　2.喹赛多作用L-02细胞产生的生物学效应
　　通过RNAi实验抑制L-02细胞内的hnRNP A2/B1后，用实时荧光定量qRT-PCR检测喹赛多作用前后hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21 mRNA的表达变化。结果发现将L-02细胞内hnRNP A2/B1干扰后5种基因的mRNA表达水平均有显著性下调，说明在L-02细胞内这4种基因与hnRNPA2/B1关系密切。同时，使用2μM喹赛多孵育L-02细胞1h后，空白加药组与干扰加药组之间各基因表达相比均有显著性差异，说明hnRNP A2/B1对喹赛多调节下游基因有重要的作用。结合SPR实验结果喹赛多在体外能直接与hnRNP A2/B1结合，推测喹赛多在L-02细胞内也很有可能通过与hnRNPA2/B1结合产生效应。
　　用2μM喹赛多孵育L-02细胞1h后，通过qRT-PCR检测到hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21的mRNA水平均有显著性的上调，可以推测喹赛多作用于L-02细胞后，与细胞生长和增殖密切相关的mki-67和c-myc的mRNA水平随着hnRNPA2/B1的上调而上调，随着时间的延长，与细胞周期及凋亡相关的ccnd2及p21等基因出现了负反馈调节，控制细胞生长的速度。
　　综上所述，本课题通过SPR和RNAi实验研究了喹赛多与hnRNP A2/B1的相互作用和喹赛多作用细胞后引起的生物学效应，发现hnRNP A2/B1在体外能与喹赛多直接结合，且Lys(101)是其相互作用中的关键结合位点，Arg(102)则对hnRNPA2/B1与喹赛多的结合有一定的影响。喹赛多作用于L-02细胞后，与细胞生长和增殖密切相关的mki-67和c-myc的mRNA水平随着hnRNP A2/B1的上调而上调，可能使细胞增殖加快。同时为了保持细胞内的动态平衡，避免出现异常的过度增殖，与细胞周期及细胞凋亡相关的ccnd2及p21基因出现了负反馈调节，减缓细胞增殖的速度。因此，喹赛多作用于L-02细胞后很有可能与hnRNP A2/B1相结合激活下游通路，通过调节与细胞生长、增殖、凋亡相关基因的表达发挥促生长作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究背景

1．1．1 喹赛多研究进展

1．1．2 核内不均一核糖核蛋白A2／B1研究进展

1．1．3 药物小分子与蛋白质相互作用关系的研究方法

1．2 研究思路

1．3 研究内容

1．4 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 细胞株

2．2 药品和试剂

2．3 主要仪器和设备

2．4 溶液配制

2．5 L-02细胞的复苏、培养、传代与冻存

2．6 野生型pET28a-hnRNP A2／B1及突变质粒的构建

2．6．1 细胞处理及分组

2．6．2 细胞总RNA的提取

2．6．3 细胞总RNA纯度、浓度及完整性的检测

2．6．4 逆转录反应

2．6．5 普通PCR扩增目的基因

2．6．6 hnRNP A2／B1与表达载体pET28a的连接

2．6．7 突变质粒的构建

2．7 野生型hnRNP A2／B1及突变蛋白的表达

2．7．1 蛋白表达最佳条件摸索与可溶性分析

2．7．2 蛋白浓度的测定

2．7．3 SDS-PAGE电泳

2．7．4 Western Blot免疫印迹

2．8 野生型hnRNP A2／B1及突变蛋白的纯化

2．8．1 His-tag亲和Ni柱纯化目的蛋白

2．8．2 蛋白质的透析和浓缩

2．9 表面等离子体共振实验(SPR)

2．10．2 检测转染效率-转染荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)

2．10．3 转染条件的优化

2．10．5 qRT-PCR检测hnRNP A2／B1 mRNA的表达水平

2．10．6 细胞总蛋白的提取

2．10．7 Western Blot免疫印迹检测hnRNP A2／B1蛋白的表达

2．11 喹赛多作用及hnRNP A2／B1干扰对细胞产生的影响

2．11．1 细胞处理及分组

2．11．2 qRT-PCR检测hnRNP A2／B1及细胞增殖相关基因mRNA的表达水平

2．11．3 Western Blot免疫印迹检测hnRNPA2／B1的表达

2．12 数据处理

3 结果

3．2 细胞总RNA的质量检测结果

3．3．1 目的基因的扩增

3．3．2 野生型及突变质粒的浓度和质量

3．3．3 野生型及突变质粒测序结果

3．4 野生型及突变蛋白的原核表达

3．4．1 蛋白表达最佳诱导条件

3．4．2 Western Blot验证目的蛋白

3．5．1 蛋白纯化最佳洗脱条件

3．5．2 野生型及突变蛋白浓度的检测

3．5．3 Western Blot免疫印迹验证结果

3．6 喹赛多与野生型及突变蛋白的相互作用检测结果

3．7 喹赛多及hnRNP A2／B1的干扰对细胞的影响

3．7．1 引物可靠性验证

3．7．2 干扰条件的确定

3．7．3 喹赛多及hnRNP A2／B1的干扰对细胞增殖相关基因表达的影响

4 讨论

4．1 纯化方法对蛋白纯化结果的影响

4．2 喹赛多和hnRNP A2／B1的结合特性

4．3 喹赛多通过hnRNP A2／B1介导细胞增殖相关基因的表达

5 全文总结

6 文献综述 核内不均一核糖核蛋白hnRNPs研究进展

参考文献

附录

个人简历

致谢