血清4型禽腺病毒的分离鉴定和油乳剂灭活苗的初步研究

摘要

禽腺病毒对鸡群危害最严重的两种疾病是包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis, IBH)和心包积水肝炎综合征（Hepatitishydropericardium syndrome, HHS）。该群禽腺病毒可分为5个种（A-E）和12个血清型（1-8a和8b-11），其所有的12个血清型都与包涵体肝炎密切相关。该病主要对3-5周龄鸡致病，主要症状为肝脏坏死出血点，肝细胞大量嗜酸性或嗜碱性核内包涵体聚集。血清4型禽腺病毒是心包积水肝炎综合征的主要病原，部分毒株致死率高达100％，其典型症状是3-5周龄肉鸡突然死亡，剖检心包大量透明或琥珀色水样或凝胶状液体聚集，肝脏出血坏死和肝细胞镜检大量嗜碱性核内包涵体。
　　本研究主要内容包括：⑴从河南、湖北和山东三个发病严重的省份分离到了五个毒株，并根据已公布的禽腺病毒全基因组序列设计引物进行鉴定，结果显示所有毒株均属于禽腺病毒。基于全基因组的遗传进化分析和同源性对比分析表明，所有毒株均与血清4型禽腺病毒参考毒株同源性最高，亲缘关系最近。理化特性研究表明，五个毒株均无凝集鸡和大鼠红细胞的能力，对氯仿、乙醚具有抵抗力，对温度有一定抵抗力，耐酸、不耐碱。HB-2，SD-1和HN-1三个毒株均能在鸡胚上稳定增殖，产生典型病变。病毒回归试验表明不同毒株对鸡群呈现明显不同的致死率。病死鸡剖检呈现心包积水和肝炎等典型症状。镜检观察肝细胞中出现大量嗜碱性核内包涵体。收集鸡胚尿囊液进行蔗糖梯度离心纯化后进行电镜观察，可见明显呈现球型禽腺病毒颗粒。所有研究结果均表明分离到的病毒为血清4型禽腺病毒。⑵病毒经鸡胚增殖传代达到疫苗研制要求后，本研究进行了灭活苗制备条件的初步研究以及优势毒株的筛选。结果表明，1/1000终浓度的甲醛24h即可完全灭活病毒，以该抗原制备的疫苗无安全隐患，可用于免疫实验。免疫保护实验和抗体消长实验表明，以HB-2和SD-1为抗原的灭活苗均能为白来航蛋鸡提供100%的保护力。其中，HB-2毒株灭活苗诱导产生抗体转阳速度更快、滴度更高，是灭活苗制备的优势毒株。⑶病毒在鸡胚增殖进行灭活苗研制虽然可行，但是毒价较低且不稳定。因此，选取鸡肝癌细胞细胞系对HB-2毒株进行增殖传代，直至产生较高稳定的毒价用于疫苗的研制。血清中和试验表明，HB-2毒株制备的阳性血清中和效价高达10-2.208。致瘤试验证明灭活LMH细胞无致瘤能力，可用于灭活苗的制备。免疫保护实验表明，以HB-2病毒为抗原的细胞毒灭活苗能为白来航蛋鸡和欣华2号蛋鸡提供提供保护力，可作为该病防治一个候选疫苗。

目录

声明

缩略语表（Abbreviations）

1文献综述

1.1 腺病毒概述

1.1. 1禽腺病毒的分类

1.1. 2禽腺病毒的形态学和理化特征

1.1.3基因组结构

1.1.4主要蛋白及其功能

1.1.5致瘤性

1.2 I群禽腺病毒的流行病学与致病性

1.3 I群禽腺病毒感染的诊断

1.3.1病理组织学诊断

1.3.2 病毒分离

1.3.3 血清学诊断技术

1.3.4 分子生物学诊断技术

1.4 I群禽腺病毒感染的防治

1.4.1 I群禽腺病毒油乳剂灭活苗的研制

1.4.2 I群禽腺病毒亚单位疫苗的研制

1.5研究的目的和意义

2.1.1病料

2.1.2细胞、鸡胚和实验动物

2.1.3仪器和设备

2.1.4主要试剂

2.2方法

2.2.1鉴定引物的设计合成

2.2.2病毒分离与传代

2.2.3病毒 DNA 的提取

2.2.4分离毒株的 PCR鉴定及全基因组扩增测序

2.2.5 病毒的血凝性测定

2.2.6 理化特性研究

2.2.7 毒株的致病性研究

2.2.8尿囊液离心纯化及电镜观察

2.3灭活疫苗的初步研究

2.3.1灭活疫苗制备条件的初步探索及优势毒株的筛选

2.3.2 LMH细胞毒灭活疫苗的初步研究

3结果与分析

3.1禽腺病毒的分离鉴定

3.1.1 PCR鉴定

3.1.2毒株传代和EID50的测定

3.1.3病毒的血凝特性

3.1.4毒株的理化特性

3.1.5遗传进化分析和同源性对比

3.1.6病毒回归试验

3.1.7剖检病变

3.1.8组织学观察

3.1.9电镜观察

3.2油乳剂灭活苗的初步研究

3.2.1灭活疫苗制备条件的初步探索及优势毒株的筛选

3.2.2细胞毒灭活疫苗的初步研究

4讨论

4.1血清4型禽腺病毒的分离鉴定

4.2病毒的培养增殖

4.3最小免疫剂量和免疫次数的确定

4.4 细胞毒蛋鸡免疫保护效果评价

5结论

参考文献

附录

致谢